सद्याचो *सद्याचो पत्तो: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सेलन्स क्लस्टर रिसर्च ऑन सेलुलर स्ट्रेस रिस्पॉन्स इन एजिंग-रिलेटेड डिजीज (सीईसीएडी).
मायटोकॉंड्रियल रोगांचें तंत्रिका क्षय अपरिवर्तनीय मानतात कारण तंत्रिका कोशिकांची चयापचयाची प्लास्टिसिटी मर्यादीत आसता, पूण मायटोकॉंड्रियल विकृततायेचो कुडींतल्या तंत्रिका कोशिकांच्या चयापचयाच्या कोशिका स्वायत्ततेचेर जावपी परिणाम बरोच समजूंक ना. हांगा आमी मायटोकॉंड्रियल संलयन गतीविज्ञानांत व्यत्यय आयिल्ल्यान प्रगतीशील OXPHOS उणाव आशिल्ल्या पुर्किन्जे तंत्रिका कोशिकांच्या कोशिकाविशिश्ट प्रोटीओमाची वळख करून दितात. मायटोकॉंड्रियल विकृततायेक लागून प्रोटीओमिक्साच्या मळार खोलायेन बदल जालो आनी निमाणें पेशी मरचेपयलीं अचूक चयापचयाच्या कार्यावळींची क्रमवार सक्रियता जाली अशें आमी पळयलें. अनपेक्षीतपणान आमी पायरुव्हेट कार्बोक्झीलेज (PCx) आनी टीसीए चक्राच्या मध्यवर्ती पदार्थांक पूरक आशिल्ल्या हेर पिरायेच्या विरोधी एंझायमांची स्पश्ट प्रेरणा थारायली. पीसीएक्साचेर आळाबंदा हाडल्यार ऑक्सिडीभवन ताण आनी तंत्रिका क्षयरोग वाडटा, हाचेवयल्यान ऑक्सफॉस नाशिल्ल्या तंत्रिका कोशिकांत धमनीकाठिन्यचो संरक्षणात्मक परिणाम जाता अशें दिसून येता. निमाणे कडेन क्षीण जाल्ल्या तंत्रिका कोशिकांतल्या मायटोकॉंड्रियल संलयनाची पुनर्स्थापना जाल्ल्यान हीं चयापचयाचीं खाशेलपणां पुरायपणान उलटतात आनी ताका लागून पेशींचें मरण आडावप जाता. आमच्या सोदांतल्यान मायटोकॉंड्रियल विकृततायेक लवचीकपण दिवपी आदीं अज्ञात आशिल्ले मार्ग वळखतात आनी रोगाच्या निमाण्या टप्प्यांत लेगीत तंत्रिका क्षयरोग उलटूं येता अशें दिसून येता.
तंत्रिका कोशिका ऊर्जा चयापचय सांबाळपाक मायटोकॉंड्रियाची केंद्रीय भुमिका मनशाच्या मायटोकॉंड्रियल रोगांकडेन संबंदीत आशिल्ल्या विस्तारीत तंत्रिका लक्षणांक लागून भर दितात. हे चडशे रोग मायटोकॉंड्रियल जीन अभिव्यक्तीचें नियंत्रण करपी जीन उत्परिवर्तन (1, 2) वा मायटोकॉंड्रियल गतीविज्ञानाक संबंदीत जीन नाश हाका लागून जातात, जाचो मायटोकॉंड्रियल डीएनए (mtDNA) स्थिरतायेचेर अप्रत्यक्ष परिणाम जाता (3, 4). जनावरांच्या आदर्शांतल्या वावरांतल्यान भोंवतणच्या ऊतकांतल्या मायटोकॉंड्रियल विकृततायेक जाप दितना पुरातनवादी चयापचयाचे मार्ग (5-7) सक्रिय करूं येतात, जाका लागून ह्या जटिल रोगांच्या रोगजंतू निर्माण जावपाची खोलायेन समजूत मेळोवपाखातीर म्हत्वाची म्हायती मेळटा अशें दिसून आयलां. हाचे उरफाटें मेंदवाच्या मायटोकॉंड्रियल अॅडेनोसायन ट्रायफॉस्फेट (ATP) उत्पादनांतल्या सामान्य अपयशाक लागून जावपी विशिश्ट पेशी प्रकारांतल्या चयापचयांतल्या बदलांविशीं आमची समजूत मुळावी आसा (8), रोग आडावपाखातीर वा आडावपाक वापरूं येतात अशे उपचारात्मक लक्ष्य वळखुपाची गरज आसा हाचेर भर दिला. तंत्रिका क्षयरोग आडावप (9). भोंवतणच्या ऊतकांच्या पेशी प्रकारांपरस तंत्रिका पेशींची चयापचयाची लवचीकता खूब मर्यादीत अशें सगळेकडेन मानतात हें म्हायतीचो उणाव आसा (10). सिनॅप्टिक संक्रमणाक चालना दिवपाखातीर आनी जखमी आनी रोगाच्या परिस्थितीक प्रतिसाद दिवपाखातीर तंत्रिका कोशिकांक चयापचय पदार्थांची पुरवण समन्वयीत करपाक ह्यो पेशी केंद्रीय भुमिका करतात हें मतींत घेतल्यार मेंदवाच्या ऊतकांच्या आव्हानात्मक परिस्थितीकडेन कोशिकांच्या चयापचयाक अनुकूल करपाची तांक चड करून ग्लिअल पेशींमेरेन मर्यादीत आसता (11-14). तेभायर मेंदवाच्या ऊतकांतल्या अंतर्निहित कोशिकीय विषमतायेक लागून विशिश्ट तंत्रिका कोशिकांच्या उपसमूहांत जावपी चयापचयांतल्या बदलांचो अभ्यास करपाक चड करून आडमेळीं येतात. ताका लागून तंत्रिका कोशिकांतल्या मायटोकॉंड्रियल विकृततायेचे नेमके कोशिकीय आनी चयापचयाचे परिणाम हांचेविशीं चडशी म्हायती मेळना.
मायटोकॉंड्रियल विकृततायेचे चयापचयाचे परिणाम समजून घेवपाखातीर आमी मायटोकॉंड्रियल भायल्या पड्ड्याच्या संलयनाच्या (Mfn2) नाशाक लागून जावपी तंत्रिका क्षयरोगाच्या वेगवेगळ्या टप्प्यांतल्या पुर्किन्जे तंत्रिका कोशिका (PNs) वेगळे केले. मनशांतल्या Mfn2 उत्परिवर्तनाचो संबंद जरी चारकोट-मारी-टूथ प्रकार 2A (15) ह्या नांवान वळखतात त्या वंशपरंपरेन जावपी मोटर संवेदी तंत्रिका विकृतीच्या एका प्रकाराकडेन आसलो तरी मुयांमदीं Mfn2 चो सशर्त नश्ट जावप ही ऑक्सिडीभवनाची बरी वळख आशिल्ली फॉस्फोरिलेशन (OXPHOS) विकृतताय पद्दत आसा. वेगवेगळे तंत्रिका कोशिकेचे उपप्रकार (16-19) आनी ताका लागून जावपी तंत्रिका विकृत फेनोटायपावांगडाच हालचालीचे विकार (18, 19) वा सेरेबॅलर अॅटॅक्सिया (16) अशीं प्रगतीशील तंत्रिका तंत्राचीं लक्षणां दिसतात. लेबल मुक्त परिमाणात्मक (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिंग आनी व्हायरॉलॉजीकल पद्दतींचो मेळ वापरून आमी दाखयतात की प्रगतीशील तंत्रिका क्षय पायरुव्हेट कार्बोक्झीलेज (PCx) आनी हेर घटकांक खरपणान प्रेरीत करता जे पीएनच्या धमनीकाठिन्यांत आस्पावतात इन विव्हो एंझायमांची अभिव्यक्ती. ह्या सोदाची प्रासंगिकता तपासपाखातीर आमी Mfn2-उणाव आशिल्ल्या पीएनांतल्या PCx च्या अभिव्यक्तीचें खासा नियंत्रण उणें केलें आनी ह्या ऑपरेशनाक लागून ऑक्सिडीभवन ताण वाडटा आनी तंत्रिका क्षयरोग वाडटा अशें दिसून आयलें, अशे तरेन अॅझोस्पर्मिया कोशिका मरणाक चयापचयाची अनुकूलताय दिता हें सिध्द जालें. एमएफएन2 ची खर अभिव्यक्ती जाल्ल्यान ऑक्सफॉसाची खर उणाव, मायटोकॉंड्रियल डीएनएचो व्हड प्रमाणांत वापर आनी मायटोकॉंड्रियल जाळें मोडून पडलां अशें दिसपी टर्मिनल डिजनरेशन पीएन पुरायपणान सोडोवंक मेळटा, जें तंत्रिका क्षयरोगाचें हें रूप पेशी मरचेपयलीं रोगाच्या प्रगत टप्प्यांत लेगीत बरे जावंक शकता हाचेर आनीक भर दिता.
Mfn2 नॉकआउट पीएनांतल्या मायटोकॉंड्रियाचें दृश्टीकोन करपाखातीर आमी Cre-आदारीत मायटोकॉंड्रियाक हळडुव्या फ्लुओरेसेंट प्रथिन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्तीचें लक्ष्य करपाक मेळपी मुयाचो जात वापरलो आनी मायटोकॉंड्रियल आकृतीबंध विव्होंत तपासलो. पीएनांतल्या Mfn2 जनुकाची नाश जाल्यार मायटोकॉंड्रियल जाळयेचें ल्हव ल्हव विभाजन जातलें अशें आमी पळयलें (आकृती S1A), आनी सगळ्यांत पयलीं बदल पिरायेच्या 3 सप्तकांत दिसून आयलो. हाचे उरफाटें पीएन पेशी थराचे व्हड प्रमाणांत क्षय जावप, ताचो पुरावो कॅल्बिंडीन इम्युनोस्टॅनिंग ना जाल्ल्यान, पिरायेच्या 12 सप्तकांमेरेन सुरू जालें ना (आकृती 1, अ आनी ब). मायटोकॉंड्रियल आकृतीबंधांतल्या सगळ्यांत पयलीं जावपी बदल आनी तंत्रिका कोशिकांच्या मरणाची दिसपी सुरवात हांचेमदलो वेळ बेजोडपणाक लागून पेशी मरणापयलीं मायटोकॉंड्रियल विकृततायेक लागून जावपी चयापचयांतल्या बदलांची चवकशी करपाक प्रवृत्त जाली. आमी वायएफपी (YFP+)-अभिव्यक्त करपी पीएन (आकृती 1C), आनी नियंत्रण मुयांमदीं (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) वेगळें करपाखातीर प्रतिदीप्ति-सक्रीय कोशिका क्रमवारी (FACS) आदारीत रणनिती तयार केली (आकृती S1B). वायएफपी संकेताच्या सापेक्ष तीव्रतेचेर आदारिल्ल्या गेटींग रणनितीचें अनुकूलन आमकां बिगर-पीएन (YFPneg) (आकृती S1B) वा अनुमानीत प्रतिदीप्त अक्षतंतू/डेंड्रिटिक तुटके (YFPlow; आकृती S1D, डावें) हांचेपसून पीएनांचे YFP+ शरीर (YFPhigh) शुध्द करपाक मेळटा, जी कॉनफोकल सूक्ष्मदर्शकावरवीं पुष्टी जाता (आकृती S1D, उजवें). वर्गीकृत लोकसंख्येची वळख तपासपाखातीर आमी एलएफक्यू प्रोटीओमिक्स आनी मागीर मुखेल घटक विश्लेशण केलें, आनी वायएफपीहाई आनी वायएफपीनेग पेशींमदीं स्पश्ट वेगळेपण आसा अशें दिसून आयलें (आकृती S1C). YFPhigh पेशींनी ज्ञात PNs मार्करांची (म्हळ्यार Calb1, Pcp2, Grid2 आनी Itpr3) निव्वळ समृध्दी दिसून आयली (21, 22), पूण सादारणपणान तंत्रिका कोशिका वा हेर कोशिका प्रकारांत अभिव्यक्त जावपी प्रथिनांची समृध्दी नाशिल्ली (आकृती 1D) ). स्वतंत्र प्रयोगांत एकठांय केल्ल्या वर्गीकृत YFPhigh पेशींतल्या नमुन्यांची तुळा केल्यार सहसंबंद गुणांक> 0.9 दिसून आयलो, जाका लागून जैविक प्रतिकृतींमदीं बरी पुनरुत्पादनक्षमता दिसून आयली (आकृती S1E). सारांशांत, ह्या डेटान शक्य आशिल्ल्या पीएनच्या तीव्र आनी विशिश्ट वेगळेपणाची आमची येवजण प्रमाणीत केली. वापरिल्ली L7-cre ड्रायव्हर प्रणाली प्रसुती उपरांत पयल्या सप्तकांत मोझाईक पुनर्संयोजन प्रेरीत करता देखून (23), आमी CTRL कडल्यान मुयांक मारपाक सुरवात केली आनी सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) तंत्रिका कोशिका एकठांय करपाक सुरवात केली. पुनर्संयोजन पुराय जातकच पिरायेच्या ४ सप्तकांत ताका Mfn2cKO अशें म्हण्टात. निमाणो बिंदू म्हूण आमी 8 सप्तकां पिराय निवडली जेन्ना पीएन थर स्पश्ट मायटोकॉंड्रियल विखंडन आसून लेगीत अखंड आशिल्लो (आकृती 1B आनी आकृती S1A). वट्ट आमी वट्ट ३०१३ प्रथिनांचें प्रमाण थारायलें, तातूंतले सुमार २२% मायटोकॉंड्रियल प्रोटीओमाचेर आदारिल्ल्या मायटोकॉंड्रिया 2.0 टिपणीचेर आदारीत आशिल्ले (आकृती 1E) (आकृती 1E) (24). ८ व्या सप्तकांत केल्ल्या विभेदक जीन अभिव्यक्ती विश्लेशणांत सगळ्या प्रथिनांतल्या फकत १०.५% प्रथिनांत म्हत्वाचे बदल जाल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती १एफ आनी आकृती एस१एफ), तातूंतली १९५ प्रथिनां डाउन-रेग्युलेटेड आनी १२० प्रथिनां अप-रेग्युलेटेड आशिल्लीं (आकृती १एफ). ह्या डेटा संचांतल्या “नवीन मार्ग विश्लेशणा” प्रमाण विभेदक रितीन अभिव्यक्त जाल्लीं जीनां मुखेलपणान विशिश्ट चयापचयाच्या मार्गांच्या मर्यादीत संचांत येतात हें लक्षांत घेवपासारकें आसा (आकृती 1G). मजेची गजाल म्हळ्यार OXPHOS आनी कॅल्शियम संकेत हांचेकडेन संबंदीत आशिल्ल्या मार्गांचें डाउनरेग्युलेशन जरी संलयन-उणाव आशिल्ल्या पीएनांत मायटोकॉंड्रियल विकृतताय निर्माण जावपाची खात्री करता तरी मुखेलपणान अॅमिनो अॅसिड चयापचयाचो आस्पाव आशिल्ल्या हेर वर्गांचें म्हत्वाचें अपरेग्युलेशन जाता, जें मायटोकॉंड्रियल चयापचयांत जावपी चयापचयाकडेन जुळटा रिवायरींग हें पीएन सुसंगत आसता. विकार जावप.
(अ) सीटीआरएल आनी एमएफएन2सीकेओ मुयाच्या सेरिबॅलर विभागांचे प्रतिनिधीक कॉनफोकल फोटो, तातूंत पीएन (कॅल्बिंडीन, ग्रे) चें क्रमीक लुकसाण दिसून येता; अणुकेंद्रांक डीएपीआय हांणी प्रतिरंजित केल्ले. (ब) (अ) चें प्रमाणीकरण (व्हेरिएन्साचे एकतरफा विश्लेशण, ***P<0.001; n = तीन मुयांपसून 4 ते 6 वर्तुळ). (ग) प्रायोगिक कार्यप्रवाह. (D) पुर्किन्जे (वयर) आनी हेर कोशिका प्रकारांक (मदीं) विशिश्ट अशा निशाणांचें उश्णताय नकाशाचें वितरण. (E) वर्गीकृत पीएनांत वळखून घेतिल्ल्या मायटोकॉंड्रियल प्रथिनांची संख्या दाखोवपी व्हेन आकृती. (F) 8 सप्तकांत Mfn2cKO तंत्रिका कोशिकांतल्या विभेदक रितीन अभिव्यक्त जाल्ल्या प्रथिनांचे ज्वालामुखी प्लॉट (महत्वाचे कट-ऑफ मोल 1.3). (G) सृजनशीलताय मार्ग विश्लेशणांत 8 सप्तकां अशें वर्गीकरण केल्ल्या Mfn2cKO पीएनांतले पांच म्हत्वाचे अप-रेग्युलेशन (तांबडो) आनी डाउन-रेग्युलेशन (निळो) मार्ग दाखयल्यात. दर एका सोदून काडिल्ल्या प्रथिनाची सरासरी अभिव्यक्ती पातळी दाखयल्या. ग्रेस्केल उश्णताय नकासो: समायोजित पी मोल. ns, म्हत्वाचें न्हय.
प्रोटीओमिक्साच्या डेटावयल्यान I, III आनी IV ह्या संयुगांची प्रथिन अभिव्यक्ती ल्हव ल्हव उणी जायत गेली. I, III आनी IV ह्या संकुलांत सगळ्यांत गरजेचे mtDNA संकेतबध्द उपखंड आशिल्ले, जाल्यार फकत अणुकेंद्रीय संकेत आशिल्ले संयुग II हातूंत मुळाव्यान ताचो परिणाम जालो ना (आकृती 2A आनी आकृती S2A). . प्रोटीओमिक्साच्या परिणामांकडेन जुळपी सेरेबॅलर ऊतक विभागांच्या प्रतिरक्षी आंतकड्यांच्या रसायनशास्त्रांतल्यान पीएनांतल्या संकुल IV च्या एमटीसीओ१ (मायटोकॉंड्रियल सायटोक्रोम सी ऑक्सिडेज उपखंड १) उपखंडाची पातळी ल्हव ल्हव उणी जाल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती २ बी). mtDNA-संकेतित उपखंड Mtatp8 खूब उणो जालो (आकृती S2A), जाल्यार अणुकेंद्रीय संकेतित एटीपी सिंथेज उपखंडाची स्थिर स्थितीची पातळी बदलूंक ना, जी mtDNA अभिव्यक्ती स्थिर आसतना ज्ञात स्थिर एटीपी सिंथेज उपसंयोजन F1 संकुलाक जुळटा. ही निर्मिती एकसारकी आसता. खंडीत करप (7). क्रमवारीत केल्ल्या Mfn2cKO पीएनांतल्या mtDNA पातळेचें रियल-टायम पॉलिमरेझ साखळी विक्रिया (qPCR) वरवीं मूल्यमापन केल्ल्यान mtDNA प्रत संख्या ल्हव ल्हव उणी जाल्ल्याची खात्री जाली. नियंत्रण गटाचे तुळेंत ८ सप्तकां पिरायेचेर mtDNA पातळेचें फकत सुमार २०% प्रमाण तिगून उरलें (आकृती २ सी). ह्या परिणामांकडेन जुळपी Mfn2cKO PNs च्या कॉनफोकल मायक्रोस्कोपी रंगोवपाचो उपेग करून डीएनए सोदून काडलो, तातूंतल्यान मायटोकॉंड्रियल न्यूक्लिओटायडांचो वेळावयल्यान आदारीत वापर दिसून आयलो (आकृती 2D). मायटोकॉंड्रियल प्रथिनांच्या विघटनांत आनी ताण प्रतिसादांत वांटो घेवपी फकत कांय उमेदवारांचें अप-रेग्युलेट जाल्लें आमी पळयलें, तातूंत Lonp1, Afg3l2 आनी Clpx, आनी OXPHOS जटिल संयोजन घटक हांचो आस्पाव जाता. अपोप्टोसीसांत आस्पाव आशिल्ल्या प्रथिनांच्या पातळेंत व्हडलोसो बदल दिसूंक ना (आकृती S2B). तेच प्रमाण कॅल्शियम येरादारींत आस्पाव आशिल्ल्या मायटोकॉंड्रिया आनी अंतःप्लाझ्मीक रेटिक्युलम वाहिनींत फकत ल्हान ल्हान बदल जातात अशें आमी पळयलें (आकृती S2C). तेभायर ऑटोफेजी संबंदीत प्रथिनांच्या मूल्यमापनांत म्हत्वाचो बदल दिसूंक ना, जो प्रतिरक्षी आंतकड्यांच्या रसायनशास्त्र आनी इलॅक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शकावरवीं विव्होंत पळोवपाक मेळपी ऑटोफॅगोझोमाच्या दृश्य प्रेरणेकडेन जुळटा (आकृती S3). पूण पीएनांतल्या प्रगतीशील ऑक्सफोस विकृततायेवांगडाच स्पश्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल मायटोकॉंड्रियल बदल घडटात. ५ आनी ८ सप्तकां पिरायेच्या Mfn2cKO PN च्या कोशिका कुडींत आनी डेंड्रिटिक झाडांत मायटोकॉंड्रियल चोमे पळोवंक मेळटात आनी भितरल्या पड्ड्याच्या संरचनेंत खोलायेन बदल जाल्यात (आकृती S4, A आनी B). ह्या अतिसंरचनेच्या बदलांक आनी mtDNA च्या म्हत्वाच्या उणावाक अनुरूप, टेट्रामिथिलरोडामाइन मिथिल एस्टर (TMRM) च्या आदारान तीव्र मस्तिष्क मस्तिष्क स्लाइसांचें विश्लेशण केल्यार Mfn2cKO PNs हातूंतल्या मायटोकॉंड्रियल पड्ड्याची क्षमता खूब उणी जाल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती S4C).
(अ) ऑक्सफोस संकुलाच्या अभिव्यक्ती पातळेचें काळक्रमाचें विश्लेशण. फकत ८ सप्तकांत P<0.05 आशिल्लीं प्रथिनां विचारांत घेवचीं (two-way ANOVA). बिंदू रेखा: सीटीआरएलचे तुळेंत समायोजन ना. (ब) उजवे वटेन: अँटी-एमटीसीओ१ प्रतिपिंड (स्केल बार, २० मायक्रोन) अशें लेबल आशिल्ल्या मस्तिष्ककोशाच्या विभागाचें एक उदाहरण. पुर्किन्जे कोशिका पिंडांनी व्यापिल्लो वाठार हळडुव्या रंगान व्यापिल्लो आसता. उजवे वटेन: एमटीसीओ१ पातळेचें प्रमाणीकरण (व्हेरिएन्साचें एकतरफा विश्लेशण; n = तीन मुयांपसून विश्लेशण केल्ल्या ७ ते २० पेशींचें विश्लेशण). (C) क्रमवारीत केल्ल्या पीएनांतल्या mtDNA प्रत संख्याचें qPCR विश्लेशण (एकतरफा व्हेरिएन्स विश्लेशण; n = 3 ते 7 मुयो). (D) उजवे वटेन: अँटी-डीएनए प्रतिपिंड (स्केल बार, २० मायक्रोन) अशें लेबल आशिल्ल्या सेरेबॅलर स्लाइसाचें एक उदाहरण. पुर्किन्जे कोशिका पिंडांनी व्यापिल्लो वाठार हळडुव्या रंगान व्यापिल्लो आसता. उजवे वटेन: mtDNA घायांचें प्रमाणीकरण (एकतरफा व्हेरिएन्स विश्लेशण; तीन मुयांपसून n = 5 ते 9 पेशी). (E) पुराय पेशी पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंगांत मायटोवायएफपी + पुर्किन्जे पेशी (बाण) दाखोवपी तीव्र मस्तिष्ककोश विभागाचें एक उदाहरण. (F) IV वक्राचें प्रमाणीकरण. (G) CTRL आनी Mfn2cKO पुर्किन्जे कोशिकांतल्या विध्रुवीय प्रवाह इंजेक्शनाची प्रतिनिधीक नोंदी. वयलो ट्रेस: ​​एपी सुरू करपी पयलो नाडी. तळाचो ट्रेस: ​​चडांत चड एपी कंप्रता. (H) पोस्टसिनॅप्टिक स्वतःस्फूर्त इनपुट (sPSPs) चें प्रमाणीकरण. प्रतिनिधीक रेकॉर्डिंग ट्रेस आनी ताचें झूम प्रमाण (I) हातूंत दाखयलां. व्हेरिएन्साचे एकतरफा विश्लेशण करून तीन मुयांपसून n = 5 ते 20 पेशींचें विश्लेशण केलें. डेटा सरासरी±SEM अशें दर्शयतात; *पी <0.05 आनी डी. **पी <0.01 आनी डी. ***पी <0.001. (J) छिद्रीत पॅच क्लॅम्प मोड वापरून नोंद केल्ल्या सहज एपीचे प्रतिनिधीक निशाण. वयलो ट्रेस: ​​चडांत चड एपी कंप्रता. तळाचो ट्रेस: ​​एकाच एपीचो झूम. (K) (J) प्रमाण सरासरी आनी चडांत चड एपी कंप्रता प्रमाणीत करात. मान-व्हिटनी चांचणी; चार मुयांपसून n = 5 पेशींचें विश्लेशण केलें. डेटा सरासरी±SEM अशें दर्शयतात; म्हत्वाचें न्हय.
८ सप्तकां पिरायेच्या Mfn2cKO PN हातूंत OXPHOS हें स्पश्ट नुकसान दिसून आयलें, ताचेवयल्यान तंत्रिका कोशिकांचें शारिरीक कार्य सामकें असामान्य आसा अशें दिसून येता. देखून आमी तीव्र मस्तिष्ककोशीय कातड्यांनी पुराय कोशिका पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंग करून 4 ते 5 सप्तकांत आनी 7 ते 8 सप्तकांत OXPHOS-उणाव आशिल्ल्या तंत्रिका कोशिकांच्या निष्क्रिय विद्युत् खाशेलपणांचें विश्लेशण केलें (आकृती 2E). अनपेक्षीतपणान Mfn2cKO तंत्रिका कोशिकांची सरासरी विश्रांती घेवपी पड्ड्याची क्षमता आनी इनपुट प्रतिकार नियंत्रणासारकोच आशिल्लो, जरी पेशींमदीं सूक्ष्म फरक आशिल्लो (कोश्टक 1). तेच प्रमाण पिरायेच्या 4 ते 5 सप्तकांत प्रवाह-विद्युत् संबंदांत (IV वक्र) व्हडलोसो बदल दिसूंक ना (आकृती 2F). पूण 7 ते 8 सप्तकां पिरायेची खंयचीच Mfn2cKO तंत्रिका कोशिका IV पद्दतींतल्यान (हायपरपोलारायझेशन स्टेप) जिवीत उरली ना, हाचेवयल्यान ह्या निमाण्या पांवड्यार हायपरपोलरायझेशन क्षमतेक स्पश्ट संवेदनशीलताय आसा अशें दिसून येता. हाचे उरफाटें Mfn2cKO तंत्रिका कोशिकांत पुनरावृत्ती कृती विभव (AP) स्राव निर्माण करपी विध्रुवीय प्रवाह बरे तरेन सोंसतात, हाचेवयल्यान तांचे एकंदर निर्वहन पद्दती 8 सप्तकां पिरायेच्या नियंत्रण तंत्रिका कोशिकांपरस म्हत्वाचो वेगळो ना अशें दिसून येता (कोश्टक 1 आनी आकृती 2G). तेच प्रमाण स्वतःस्फूर्त पोस्टसिनॅप्टिक प्रवाहांची (sPSCs) वारंवारता आनी विस्तार नियंत्रण गटाच्या प्रवाहांकडेन तुळा करपासारको आशिल्लो आनी घडणुकांची वारंवारता 4 सप्तकांसावन 5 सप्तकांमेरेन 7 सप्तकांसावन 8 सप्तकांमेरेन वाडून अशीच वाड जाली (आकृती 2, H आनी I). पीएनांतल्या सिनॅप्टिक परिपक्वतायेचो काळ (25). छिद्रीत पीएनएस पॅच केल्या उपरांतय अशेच परिणाम मेळ्ळे. ही संरचना कोशिकीय एटीपी दोशांची संभाव्य भरपाय आडायता, जशी पुराय कोशिका पॅच क्लॅम्प रेकॉर्डिंगांत घडूंक शकता. खासा करून Mfn2cKO तंत्रिका कोशिकांच्या विश्रांती घेतिल्ल्या पड्ड्याच्या विभवाचेर आनी आपशींच फायरिंग वारंवारतायेचेर परिणाम जालो ना (आकृती 2, J आनी K). सारांशांत, हे परिणाम स्पश्ट ऑक्सफॉस विकृतताय आशिल्ले पीएन उच्च कंप्रताय स्राव पद्दतींक बरे तरेन तोंड दिवंक शकतात अशें दाखयतात, हाचेवयल्यान तांकां सामान्य लागीं लागीं विद्युत् शरीरक्रियाविज्ञानीक प्रतिसाद सांबाळपाक मेळपी भरपाय यंत्रणा आसा अशें दिसून येता.
डेटा सरासरी ± SEM (एकतरफा व्हेरिएन्स विश्लेशण, होल्म-सिडक हाची बहुतुलना चांचणी; *P<0.05) अशें दर्शयतात. एकक क्रमांक कंसांनी दाखयला.
प्रोटीओमिक्स डेटासेटांतल्या खंयच्याय वर्गांत (आकृती 1G) खर OXPHOS उणावाक प्रतिकार करपाक शकतात अशे मार्ग आसपावीत आसात काय ना हाची चवकशी करपाक आमी सुरवात केली, जाका लागून प्रभावित पीएन सामान्या लागींच्या विद्युत् शरीरक्रियाविज्ञानाक कित्याक सांबाळूंक शकता हें स्पश्ट केलें (आकृती 2, ई ते के). . प्रोटीओमिक्स विश्लेशणावरवीं फांटे आशिल्ल्या साखळी अॅमिनो अॅसिडांच्या (BCAA) चयापचयांत आस्पाव आशिल्ल्या एंझायमांचें म्हत्वाचें अप-रेग्युलेट जाल्लें दिसून आयलें (आकृती 3A आनी आकृती S5A), आनी निमाणें उत्पादन एसिटाइल-कोए (CoA) वा सक्सिनिल CoA धमनीकाठिन्य अम्ल (TCA) चक्रांतल्या ट्रायकार्बोक्झीलेटांक पूरक जावंक शकता. बीसीएए ट्रान्सअॅमिनेज १ (बीसीएटी१) आनी बीसीएटी२ ह्या दोनूय प्रकारांतलें प्रमाण वाडटा अशें आमी पळयलें. ते α-कीटोग्लुटारेटांतल्यान ग्लुटामेट तयार करून बीसीएए चयापचयाच्या पयल्या पांवड्याक उत्प्रेरक करतात (26). फांटेयुक्त साखळी कीटो अॅसिड डिहायड्रोजनेज (BCKD) संयुग तयार करपी सगळे उपखंड उर्ध्वनियंत्रीत जातात (संकुलांतल्यान मेळपी बीसीएए कार्बन स्कॅलेटनाच्या उपरांतच्या आनी अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्झीलेशनाक उत्प्रेरक जाता) (आकृती 3 अ आनी आकृती S5A). पूण क्रमवारीत केल्ल्या पीएनांत बीसीएएंतच स्पश्ट बदल दिसूंक नाशिल्ले, हो ह्या गरजेच्या अॅमिनो अॅसिडांचें कोशिकीय घेवप वाडिल्ल्यान वा टीसीए चक्राक पूरक करपाखातीर हेर स्रोतांचो (ग्लुकोज वा लॅक्टिक आम्ल) वापर जाल्ल्यान आसूं येता (आकृती एस५ बी). ऑक्सफॉस नाशिल्ल्या पीएनांनीय ८ सप्तकां पिरायेचेर ग्लुटामाइन विघटन आनी ट्रान्सअॅमिनेशन क्रिया वाडिल्ली दिसून येता, हें मायटोकॉंड्रियल एंझायम ग्लुटामिनेज (GLS) आनी ग्लुटामाइन पायरुव्हेट ट्रान्सअॅमिनेज २ (GPT2) हांच्या अप-रेग्युलेशनांतल्यान दिसून येता (आकृती ३, अ आनी क). जीएलएसचें अप-रेग्युलेशन स्प्लिस केल्ल्या समरूप ग्लुटामिनेज सी (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL चो बदल सुमार 4.5 पटींनी, P = 0.05) मेरेन मर्यादीत आसता आनी कॅन्सराच्या ऊतकांत ताचें विशिश्ट अप-रेग्युलेशन मायटोकॉंड्रियल जैव उर्जेक आदार दिवंक शकता हें लक्षांत घेवपासारकें आसा. (27) हें नांव.
(अ) उश्णताय नकाशांत ८ सप्तकां उपरांत निर्दिश्ट मार्गाखातीर प्रथिनांच्या पातळेंत जावपी गुणाकार बदल दाखयला. (B) अँटी-पीसीएक्स प्रतिपिंड (स्केल बार, 20 मायक्रोन) अशें लेबल आशिल्ल्या सेरेबॅलर स्लाइसाचें उदाहरण. हळडुवो बाण पुर्किन्जे कोशिका कुडीकडेन दाखयता. (C) धमनीकाठिन्य (multiple t-test, *FDR <5%; n = 3-5 मुयो) हो म्हत्वाचो उमेदवार म्हूण वळखून घेतिल्लो काळ अभ्यासक्रम प्रथिन अभिव्यक्ती विश्लेशण. (D) वयर: [1-13C]पायरुव्हेट ट्रेसरांत आशिल्ल्या लेबल केल्ल्या कार्बनांत प्रवेश करपाच्यो वेगवेगळ्यो मार्गां (म्हळ्यार पीडीएच वा ट्रान्स-आर्टेरियल मार्गान) दाखोवपी आराखडो. तळें: व्हायोलीन आकृतीबंधांत [1-13C]पायरुव्हेट (जोडीदार टी-परीक्षण; ** P <0.01) हें तीव्र मस्तिष्ककोशीय कातड्यांक लेबल लायल्या उपरांत अॅस्पार्टिक आम्ल, सिट्रीक आम्ल आनी मॅलिक आम्लांत रुपांतरीत जाल्ल्या एकेच लेबल आशिल्ल्या कार्बनाची (M1) टक्केवारी दाखयल्या. (इ) दाखयल्ल्या मार्गाचें व्यापक काळ इतिहास विश्लेशण. फकत 8 सप्तकांनी P<0.05 आशिल्लीं प्रथिनां विचारांत घेवचीं . डॅश रेखा: समायोजन मोल ना (व्हेरिएन्साचे द्विपक्षीय विश्लेशण; * पी <0.05; *** पी <0.001). डेटा सरासरी±SEM अशें दर्शयतात.
आमच्या विश्लेशणांत बीसीएए कॅटाबोलिझम हो एक मुखेल अप-रेग्युलेशन मार्ग जाला. ही गजाल खरपणान सुचयता की ऑक्सफोस नाशिल्ल्या पीएनांत टीसीए चक्रांत प्रवेश करपी हवामानाचे प्रमाण बदलूं येता. हें तंत्रिका कोशिका चयापचयाच्या तारांकनाचें एक मुखेल प्रकार दाखोवंक शकता, जाचो तंत्रिका कोशिकांच्या शरीरक्रियाविज्ञानाचेर आनी खर ऑक्सफॉस विकृतताय सांबाळपाच्या वेळार जिवीत उरपाचेर थेट परिणाम जावं येता. हे कल्पनेक अनुरूप अशें आमी पळयलें की मुखेल अँटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एंझायम PCx अप-रेग्युलेटेड (Mfn2cKO/CTRL सुमार 1.5 पटींनी बदलता; आकृती 3A), जें पायरुव्हेटाचें ऑक्सालोएसिटेटांत रुपांतर करपाक उत्प्रेरक करता (28), जें मेंदवाच्या ऊतकांत आसता अशें मानतात The expression in is restricted to astrocytes (29, 30). प्रोटीओमिक्साच्या परिणामांकडेन जुळपी कॉनफोकल मायक्रोस्कोपींतल्यान ऑक्सफोस-उणाव आशिल्ल्या पीएनांत पीसीएक्स अभिव्यक्ती विशिश्ट आनी म्हत्वाची वाड जाल्ल्याचें दिसून आयलें, जाल्यार पीसीएक्स प्रतिक्रियाशीलता मुखेलपणान नियंत्रणाच्या लागसारच्या बर्गमन ग्लिअल पेशींमेरेन मर्यादीत आशिल्ली (आकृती ३ बी). PCx च्या निरिक्षण केल्ल्या अपरेग्युलेशनाची कार्यात्मक चांचणी करपाखातीर आमी [1-13C]पायरुव्हेट ट्रेसर हांणी तीव्र मस्तिष्ककोशीय कातड्यांचेर उपचार केलो. पायरुव्हेटाचें ऑक्सिडीभवन पायरुव्हेट डिहायड्रोजनेज (PDH) वरवीं जालें तेन्ना ताचें समस्थानिक लेबल ना जालें , पूण पायरुव्हेटाचें चयापचय रगतपेशींच्या विक्रियांनी जाता तेन्ना TCA चक्राच्या मध्यवर्ती पदार्थांत आस्पावता (आकृती 3D). आमच्या प्रोटीओमिक्स डेटाच्या आदारान आमी Mfn2cKO कातड्यांच्या अॅस्पार्टिक आम्लांत ह्या ट्रेसरांतल्यान व्हड प्रमाणांत मार्कर पळयले, जाल्यार सिट्रीक आम्ल आनी मॅलिक आम्ल हांचेय मध्यम प्रवृत्ती आशिल्ली, जरी म्हत्वाची नासली (आकृती 3D).
मायटोपार्क मुयाच्या डोपामाइन तंत्रिका कोशिकांनी मायटोकॉंड्रियल ट्रान्सक्रप्शन फॅक्टर ए जीन (Tfam) (Tfam) (आकृती S6B) खासा नश्ट करपी मायटोकॉंड्रियल विकृतताय आशिल्ल्या डोपामाइन तंत्रिका कोशिकांत पीसीएक्स अभिव्यक्तीचेंय म्हत्वाचें अप-रेग्युलेट जाल्लें (31), हाचेवयल्यान एसीटोन अॅसिड धमनीकाठिन्य तंत्रिका कोशिकांच्या विकृतताये वेळार रोगाची घडणूक नियंत्रीत जाता अशें दिसून येता कुडींत OXPHOS. धमनीकाठिन्य संबंदीत आसूं येता अशा तंत्रिका कोशिकांत अभिव्यक्त जावंक शकतात अशे खाशेले एंझायम (32-34) ऑक्सफॉस नाशिल्ल्या पीएनांत म्हत्वाचें प्रमाणांत अप-रेग्युलेट जातात, जशे की प्रोपिओनील-कोए कार्बोक्झीलेज (PCC-A), मॅलोनील-कोए प्रोपिओनिल-कोएचें रुपांतर सक्सिनिल-कोए आनी मायटोकॉंड्रियल मॅलिक 3 (ME3), एंझायमांत करता अशें दिसून आयलां हें लक्षांत घेवपासारकें आसा. जाची मुखेल भुमिका म्हळ्यार मॅलेटांतल्यान पायरुव्हेट मेळोवप (आकृती ३, अ आनी क) (३३, ३५). तेभायर आमी पीडीएच फॉस्फोरिलेशन करपी आनी अशे तरेन पीडीएच निश्क्रीय करपी पीडीके3 एंझायमांत म्हत्वाची वाड पळयली (36), जाल्यार पीडीएच वा पीडीएच एंझायम संकुलांतच सक्रिय करपी पीडीपी1 एंझायमांत कसलोच बदल दिसूंक ना (आकृती 3 अ). सातत्यान Mern2cKO PNs हातूंत Ser293 हातूंतल्या PDH संकुलाच्या पायरुव्हेट डिहायड्रोजनेज E1 घटकाच्या α1 उपखंड α (PDHE1α) उपखंडाचें फॉस्फोरिलेशन वाडलें (आकृती S6C) (आकृती S6C). पायरुव्हेटाक रगतपेशींचो प्रवेश ना.
निमाणें आमी पळयलें की सक्रियता प्रक्रियेंत सेरीन आनी ग्लायसीन जैवसंश्लेशणाचो सुपर मार्ग, संबंदीत मायटोकॉंड्रियल फोलेट (1C) चक्र आनी प्रोलीन जैवसंश्लेशण (आकृती 1G आनी आकृती S5C) हे सगळे लक्षणीय रितीन अप-रेग्युलेट जातात अशें अहवालां प्रमाण. मायटोकॉंड्रियल विकृततायेन भोंवतणचीं ऊतकां सक्रिय जातात (5-7). ह्या प्रोटीओमिक्स डेटाक आदार दिवपी कॉनफोकल विश्लेशणावरवीं OXPHOS गळून पडल्ल्या पीएनांत ८ सप्तकां पिरायेच्या मुयाच्या सेरिबॅलर स्लाइसांक मायटोकॉंड्रियल फोलेट चक्राचें मुखेल एंझायम सेरीन हायड्रोक्सीमिथिलट्रांसफॅरेज २ (SHMT2) हें एंझायम दिल्ल्याचें दिसून आयलें. म्हत्वाचो रोगप्रतिकार प्रतिसाद (आकृती S5D). 13 सीयू-ग्लुकोज-उब्या केल्ल्या तीव्र मस्तिष्ककोशीय कातड्यांनी चयापचयाच्या ट्रेसिंग प्रयोगांनी सेरीन आनी प्रोलीन जैवसंश्लेशणाचें अप-रेग्युलेशन आनीक पुष्टी जालें आनी ताका लागून कार्बन समरूपांचें सेरीन आनी प्रोलीनांत प्रवाह वाडटा अशें दिसून आयलें (आकृती S5E). जीएलएस आनी जीपीटी2 हांणी चालना दिवपी विक्रिया ग्लुटामाइनापसून ग्लुटामेटाच्या संश्लेशणाक आनी ग्लुटामेट आनी α-कीटोग्लुटारेट हांचेमदल्या ट्रान्सएमिनेशनाक जापसालदार आशिल्ल्यान, तांचें अपरेग्युलेशन दाखयता की OXPHOS-उणाव आशिल्ल्या तंत्रिका कोशिकांक ग्लुटामेटाची मागणी वाडल्या , हाचो हेतू प्रोलीनाचें वाडिल्लें जैवसंश्लेशण सांबाळपाचो आसूं येता (आकृती S5C). ह्या बदलांच्या विपरीत पीएन-विशिश्ट Mfn2cKO मुयांपसून केल्ल्या सेरेबॅलर एस्ट्रोसायटींच्या प्रोटीओमिक विश्लेशणावरवीं ह्या मार्गांनी (सगल्या अँटीपॅरॉक्सिडायजांचो आस्पाव) अभिव्यक्तींत व्हडलोसो बदल जायना अशें दिसून आयलें, अशे तरेन हें चयापचयाचें पुनर्निर्देशन विघटन जाल्ल्या पीएनाक निवडक आसा हें दाखयलें (आकृती S6, D ते G).
सारांशांत ह्या विश्लेशणांतल्यान पीएनांतल्या विशिश्ट चयापचयाच्या मार्गांच्या काळांतराच्या सक्रियतायेचे म्हत्वाचे वेगवेगळे नमुने दिसून आयले. तंत्रिका कोशिकांच्या मायटोकॉंड्रियलाच्या असामान्य कार्याक लागून सुरवेक धमनीकाठिन्य आनी 1C रिमॉडेलिंग (आकृती 3E आनी आकृती S5C) जावंक शकता, आनी I आनी IV संयुगांच्या अभिव्यक्तींत अदमासाक येवपी बदल लेगीत जावंक शकतात, तरी सेरीन डी नोव्हो संश्लेशणांतले बदल फकत तो फकत निमाण्या टप्प्यांत दिसून आयलो. OXPHOS विकृतताय (आकृती 3E आनी आकृती S5C). ह्या सोदांतल्यान एक क्रमीक प्रक्रिया व्याख्या केल्या, जातूंत ताण-प्रेरित मायटोकॉंड्रियल (1C चक्र) आनी सायटोप्लाझ्मीक (सेरीन जैवसंश्लेशण) हांकां टीसीए चक्रांतल्या धमनीकाठिन्य वाडपावांगडा समन्वयात्मक प्रतिसाद दिवन तंत्रिका कोशिकांच्या चयापचयाचो नवो आकार मेळटा.
८ सप्तकां पोरन्या OXPHOS-उणाव आशिल्ल्या पीएन उच्च कंप्रता उत्तेजन क्रियाशीलता सांबाळूंक शकतात आनी मायटोकॉंड्रियल विकृतीची भरपाय करपाखातीर म्हत्वाचें चयापचयाचें पुनर्संयोजन करपाक शकतात. ह्या सोदाक लागून ह्या खिणाक लेगीत ह्या पेशींक तंत्रिका क्षयरोगाक कळाव वा आडावपाक उपचारात्मक हस्तक्षेपूय मेळूं येता अशी एक रोचक शक्यताय निर्माण जाता. उसरां. ही शक्यताय आमी दोन स्वतंत्र हस्तक्षेपां वरवीं सोडयली. पयले पद्दतींत आमी Cre-आदारीत अॅडेनो-संबंदीत व्हायरस (AAV) व्हॅक्टर तयार केलो, जाका लागून MFN2 निवडून OXPHOS-उणाव आशिल्ल्या PNs मदीं in vivo अभिव्यक्त करूं येता (आकृती S7A). MFN2 आनी फ्लुओरेसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) हें संकेत करपी एएव्ही हें प्राथमिक तंत्रिका कोशिका संस्कृतायेंत आंतकड्यांनी सत्यापीत केलें, जाका लागून MFN2 Cre-आदारीत पद्दतीन अभिव्यक्त जालें आनी मायटोकॉंड्रियल आकृतीबंध वाचयलो, जाका लागून Mfn2cKO तंत्रिका कोशिकांत तंत्रिका उत्परिवर्तन आडावप जालें (आकृती S7, B, D आनी E). उपरांत आमी 8 सप्तकांचो Mfn2-AAV Mfn2cKO आनी नियंत्रण मुयाच्या सेरेबॅलर कॉर्टेक्सांत स्टीरियोटॅक्टिक रितीन पावोवपाखातीर इन विव्हो प्रयोग केलो आनी 12 सप्तकांच्या मुयाचें विश्लेशण केलें (आकृती 4A). उपचार केल्ल्या Mfn2cKO मुयांक मरण आयलें (आकृती 1, अ आनी ब) (16). विव्हो हातूंत व्हायरस संक्रमणाक लागून कांय मस्तिष्ककोशिक मंडळांत पीएनची निवडक अभिव्यक्ती जाली (आकृती S7, G आनी H). फकत mCherry (Ctrl-AAV) अभिव्यक्त करपी नियंत्रण एएव्हीची इंजेक्शन दिल्ल्यान Mfn2cKO जनावरांतल्या तंत्रिका क्षयरोगाच्या प्रमाणाचेर व्हडलोसो परिणाम जालो ना. हाचे उरफाटें Mfn2-AAV च्या आदारान रुपांतरीत केल्ल्या Mfn2cKOs च्या विश्लेशणांत पीएन कोशिका थराचे म्हत्वाचो संरक्षणात्मक परिणाम दिसून आयलो (आकृती 4, B आनी C). खासा करून तंत्रिका कोशिकांची घनताय नियंत्रण प्राण्यांपरस चड करून वेगळी दिसना (आकृती ४, ब आनी क, आनी आकृती एस७, एच आनी आय). एमएफएन१ ची अभिव्यक्ती पूण एमएफएन२ न्हय ही तंत्रिका कोशिकांच्या मरणाक वाचवपाक तितलीच प्रभावी आसता (आकृती ४ सी आनी आकृती एस७, सी आनी एफ), हाचेवयल्यान अस्थानिक एमएफएन१ ची अभिव्यक्ती एमएफएन२ च्या उणावाक प्रभावीपणान पूरक जावंक शकता अशें दिसून येता. एकेच पीएन पातळेचेर फुडल्या विश्लेशणावरवीं Mfn2-AAV हांणी मायटोकॉंड्रियाची अल्ट्रास्ट्रक्चर चड करून सोडयली, mtDNA पातळी सामान्य केली आनी अँटी-अँजिओजेनेसिस मार्कर PCx ची उंचेली अभिव्यक्ती उलटयली अशें दिसून आयलें (आकृती 4, C ते E). सोडयल्ल्या Mfn2cKO मुयांची विश्रांती घेतिल्ले अवस्थेंत दृश्टीन तपासणी केल्यार तांची मुद्रा आनी मोटर लक्षणां (S1 ते S3 हालचाल) सुदारल्यात अशें दिसून आयलें. निमाणें ह्या प्रयोगांतल्यान दिसून येता की ऑक्सफोसांत खर उणाव आशिल्ल्या पीएनांत एमएफएन2 ची कळाव जाल्ली परत प्रवेश एमटीडीएनएचो वापर उलटपाक आनी धमनीकाठिन्य जावपाक पुरो, जाका लागून अक्षतंतूचें क्षय आनी तंत्रिका कोशिकांचें मरण विव्होंत आडावप जाता.
(अ) दाखयल्लो चयापचयाचो मार्ग सक्रिय जातकच एमएफएन2 संकेत करपी एएव्ही इंजेक्शन दिवपाचें प्रायोगिक वेळापत्रक दाखोवपी येवजण. (B) Mfn2cKO मुयांमदीं 8 सप्तकां उपरांत रुपांतरीत केल्ल्या आनी अँटी-कॅल्बिंडीन प्रतिपिंडांनी लेबल केल्ल्या 12 सप्तकांच्या सेरिबॅलर स्लाइसांचीं प्रतिनिधीक कॉनफोकल प्रतिमा. उजवे वटेन: अक्षतंतू तंतूचें स्केलिंग. अक्षतंतूच्या झूमाचें प्रमाण ४५० आनी ७५ मायक्रोन आसता. (C) डावें: एएव्ही ट्रान्सडक्शन लूप (AAV+) हातूंतल्या पुर्किन्जे कोशिका घनतेचें प्रमाणीकरण (एकतरफा व्हेरिएन्स विश्लेशण; n = 3 मुयो). उजवे वटेन: 12 व्या सप्तकांत ट्रान्सड्यूस्ड पीएनांत mtDNA फोकस विश्लेशण (अनपेयर टी-टेस्ट; n = तीन मुयांपसून 6 पेशी). * पी <0.05; ** पी <0.01. (D) दाखयल्ल्या व्हायरल व्हॅक्टरांवांगडा रुपांतरीत केल्ल्या Mfn2cKO मस्तिष्ककोशिका विभागांच्या पीएनांचे प्रतिनिधीक संप्रेषण इलॅक्ट्रॉन सूक्ष्मचित्र. गुलाबी रंगाचो मास्क डेंड्रायटांनी व्यापिल्लो वाठार दाखयता आनी हळडुव्या बिंदू आशिल्लो चौकोन उजवे वटेन दिल्लो झूम दाखयता; n हें अणुकेंद्राचें प्रतिनिधित्व करता. स्केल बार, 1μm. (E) हातूंत 12 सप्तकांनी रुपांतरीत केल्ल्या पीएनांत पीसीएक्स रंगोवपाचें एक उदाहरण दाखयलां. स्केल बार, 20μm. ओई, अतिअभिव्यक्ती; एफसी, गुठलावप बदलप.
निमाणें आमी ऑक्सफोस विकृतताय जाल्ल्या पीएनांत पेरॉक्सिडायज-प्रेरित पेशी जिवीत उरपाचें म्हत्व सोदून काडलें. आमी मुयाच्या PCx mRNA (AAV-shPCx) हांकां खासा लक्ष्य करून AAV-shRNA (short hairpin RNA) एन्कोडिंग करपी mCherry तयार केलो आनी Mfn2cKO मुयाच्या मस्तिष्ककोशांत व्हायरस वा ताचें स्क्रेम्बल्ड नियंत्रण (AAV-scr) इंजेक्शन दिलें. पीसीएक्स अभिव्यक्ती वाडटा (आकृती ३ सी) आनी पीएन कोशिका थर अजूनय अखंड आशिल्लो (आकृती १ अ) त्या काळांत प्रभावी पीसीएक्स नॉकडावन मेळोवपाखातीर पिरायेच्या चवथ्या सप्तकांत (आकृती ५ अ) इंजेक्शन दिल्लें. पीसीएक्स (आकृती एस ८ अ) उडयल्यार पीएन मरणांत म्हत्वाचो गती येता, जी संसर्गजन्य रिंग मेरेन मर्यादीत आसता हें लक्षांत घेवपासारकें आसा (आकृती ५, ब आनी सी). पीसीएक्स अप-रेग्युलेशनाक लागून जावपी चयापचयाच्या परिणामांची यंत्रणा समजून घेवपाखातीर आमी पीसीएक्स नॉकडावन आनी एएव्ही-मध्यस्थ ऑप्टिकल बायोसेंसर Grx1-roGFP2 एकाच वेळार अभिव्यक्त केल्या उपरांत पीएनच्या रेडॉक्स स्थितीचो अभ्यास केलो (आकृती S8, B ते D) ग्लुटाथिओनाचें मुल्यांकन करपाखातीर पॅप्टायड रेडॉक्स क्षमतेंतलो सापेक्ष बदल (38). उपरांत, आमी 7 सप्तकां पिरायेच्या Mfn2cKO वा नियंत्रण लिटरमेटांच्या तीव्र मेंदवाच्या कातड्यांनी दोन-फोटॉन प्रतिदीप्ति आयुश्य प्रतिमा सूक्ष्मदर्शक (FLIM) करून FLIM परिस्थितीची खात्री केल्या उपरांत सायटोप्लाझ्मीक रेडॉक्स स्थितींत संभाव्य बदल सोदून काडली (आकृती S8, E ते G). विश्लेशणांत PCx अभिव्यक्तीचो उणाव आशिल्ल्या एकाच Mfn2cKO PNs च्या ऑक्सिडीभवन स्थितींत म्हत्वाची वाड दिसून आयली, जी नियंत्रण तंत्रिका कोशिका वा फकत scrambled shRNA अभिव्यक्त करपी Mfn2cKO PNs परस वेगळी आसता (आकृती 5, D आनी E). जेन्ना पीसीएक्स अभिव्यक्तीचें नियंत्रण सकयल जालें तेन्ना चड ऑक्सिडीभवन अवस्था दाखोवपी Mfn2cKO PNs ची टक्केवारी तीन पटींनी चड वाडली (आकृती 5E), हाचेवयल्यान PCx अप-रेग्युलेशनान क्षयरोगी तंत्रिका कोशिकांची रेडॉक्स क्षमता तिगोवन दवरली अशें दिसून येता.
(अ) दाखयल्लो चयापचयाचो मार्ग सक्रिय जातकच shPCx संकेत करपी एएव्ही इंजेक्शन दिवपाचें प्रायोगिक वेळापत्रक दाखोवपी येवजण. (B) Mfn2cKO मुयांमदल्या 8 सप्तकां पिरायेच्या सेरिबॅलर विभागांचे प्रतिनिधीक कॉनफोकल फोटो 4 सप्तकांनी ट्रान्सड्यूस करून अँटी-कॅल्सिन्युरिन प्रतिपिंडांनी लेबल केल्ले. स्केल बार, 450μm. (C) एएव्ही-ट्रांसड्यूस्ड लूपांतल्या पुर्किन्जे कोशिका घनतेचें प्रमाणीकरण (व्हेरिएन्साचे एकतरफा विश्लेशण; n = 3 ते 4 मुयो). डेटा सरासरी±SEM अशें दर्शयतात; ***पी <0.001. (D) प्रतिनिधीक एफएलआयएम चित्रांत निर्दिश्ट प्रायोगिक परिस्थितींत ग्लुटाथिओन रेडॉक्स संवेदक Grx1-roGFP2 अभिव्यक्त करपी 7 सप्तकां पिरायेच्या पीएनचें सरासरी आयुश्य दाखयलां. LUT (लुक-अप कोश्टक) प्रमाण: जिवीत उरपाचो वेळ अंतर (पिकोसेकंदांत). स्केल बार, 25μm. (E) स्तंभलेखनांत (D) (दरेक परिस्थितींत दोन मुयांमदीं n=158 ते 368 पेशी) पासून Grx1-roGFP2 आयुश्य मूल्यांचें वितरण दाखयलां. दर एका स्तंभलेखनाच्या वयर आशिल्लो पाई चार्ट: CTRL-AAV-scr च्या सरासरी आयुश्य मोलाच्या 1 SD परस चड आयुश्य मोलाच्या (तांबडो, ऑक्सिडीभवन) वा उण्या (निळें, उणें) आशिल्ल्या कोशिकांची संख्या दाखयता. (F) प्रस्तावीत मॉडेलांत तंत्रिका कोशिकांच्या पीसीएक्साच्या अपरेग्युलेशनचो संरक्षणात्मक परिणाम दाखयला.
सगळें एकठांय हाडल्यार आमी हांगा दिल्लो डेटा दाखयता की MFN2 ची परतून अभिव्यक्ती जाल्ल्यान खर OXPHOS उणाव, खर mtDNA उणी जावप आनी अत्यंत असामान्य ista सारके आकृतीबंध आशिल्ल्या प्रगत पीएनाक पुरायपणान सोडवंक मेळटा, जाका लागून प्रगत दुयेंसांत लेगीत सतत प्रगती मेळटा. तंत्रिका क्षयरोगाक लागून पेशी मरणापयलींच्या पांवड्याचो उलटपासारको पुरावो मेळटा. चयापचयाच्या लवचीकपणाच्या हे प्रमाणाचेर तंत्रिका कोशिकांची धमनीकाठिन्य (टीसीए चक्राचें एक रिवायरींग) जावपाची तांक आनीक भर दितात, जी ऑक्सफोस नाशिल्ल्या पीएनांतल्या पीसीएक्स अभिव्यक्तीचेर आळाबंदा हाडटा आनी पेशी मरण वाडयता, जाका लागून संरक्षणात्मक भुमिका करता (आकृती ५एफ).
ह्या अभ्यासांत आमी ऑक्सफॉस विकृततायेक पीएनचो प्रतिसाद चयापचयाच्या कार्यावळींनी सक्रिय जाल्ल्या विभेदक सक्रियता मार्गांतल्यान ल्हव ल्हव टीसीए चक्र धमनीकाठिन्यकडेन अभिसरण जावप असो पुरावो दिलो. आमी जायत्या पूरक पद्दतींनी प्रोटीओमिक विश्लेशणाची पुष्टी केली आनी जेन्ना खर मायटोकॉंड्रियल विकृततायेक लागून आव्हान मेळटा तेन्ना तंत्रिका कोशिकांक चयापचयाच्या लवचीकतेचें एक रूप पयलीं अज्ञात आसता अशें उक्तें केलें. आमकां अजाप म्हणल्यार पुराय रिवायरींग प्रक्रिया तंत्रिका क्षयरोगा वांगडा ल्हव ल्हव आनी अपरिवर्तनीय अशी टर्मिनल चयापचयाची स्थिती चिन्न करता अशें न्हय, पूण आमच्या डेटा प्रमाण कोशिका मरणा पयलींच्या टप्प्यांत लेगीत ती देखरेखीचो तंत्रिका कोशिका घडोवंक शकता कार्यात्मक भरपाय यंत्रणा. ह्या सोदांतल्यान तंत्रिका कोशिकांक कुडींत चयापचयाची प्लास्टिसिटी बरीच प्रमाणांत आसता अशें दिसून येता. उपरांत एमएफएन2 ची परतून वळख करून दिल्ल्यान मुखेल चयापचयाच्या निशाणांची अभिव्यक्ती उलटून पीएन क्षय जावंक शकता हें सिध्द जाता. उरफाटें धमनीकाठिन्य आडायता आनी तंत्रिका तंत्राक गती दिता. ट्रांससेक्सुअल.
आमच्या संशोधनांतलो एक आकर्शक सोद म्हळ्यार OXPHOS नाशिल्लो पीएन खासा धमनीकाठिन्य उत्तेजीत करपी एंझायमांचें अप-रेग्युलेट करून TCA चक्राच्या चयापचयांत बदल करूंक शकतात. चयापचयाची पुनर्रचना हें कॅन्सर पेशींचें एक सामान्य खाशेलपण आसून, तातूंतले कांय टीसीए चक्राच्या मध्यवर्ती पदार्थांक पूरक म्हूण ग्लुटामाइनाचेर आदारून आसतात आनी तांकां उणें करपी समतुल्य पदार्थ तयार करतात, जे श्वसन साखळीक चालना दितात आनी लिपिड आनी न्यूक्लिओटायड जैवसंश्लेशण पूर्ववर्ती पदार्थांचें उत्पादन सांबाळटात (39 , 40). हालींच्या एका अभ्यासांत ऑक्सफोस विकृतताय जाणवपी परिधीय ऊतकांत ग्लुटामाइन/ग्लुटामेट चयापचयाचें परतून जोडप हेंय एक मुखेल खाशेलपण (5, 41), जंय टीसीए चक्रांत ग्लुटामाइन प्रवेशाची दिका Because of the severity of OXPHOS जखमेचेर आदारून आसता अशें दिसून आयलां (41). ). पूण कुडींतल्या तंत्रिका कोशिकांच्या चयापचयाच्या प्लास्टिसिटीचें कसलेंच सारकेंपण आनी रोगाच्या संदर्भांत ताची संभाव्य प्रासंगिकता हांचेविशीं स्पश्ट पुरावे मेळनात. हालींच्या काळांत केल्ल्या आंतकड्यांनी केल्ल्या अभ्यासांत प्राथमिक कॉर्टिकल तंत्रिका कोशिका तंत्रिका संक्रमणाखातीर ग्लुटामेट पूल एकठांय करतात अशें दाखयलां, जाका लागून चयापचयाच्या ताण परिस्थितींत ऑक्सिडीभवन चयापचय आनी धमनीकाठिन्य वाडटा (42). टीसीए चक्र एंझायम सक्सीनेट डिहायड्रोजनेज ह्या वखदी प्रतिबंधाखाला पायरुव्हेट कार्बोक्झीलेशनाक लागून संवर्धित मस्तिष्ककोशिक कण तंत्रिका कोशिकांतल्या ऑक्सालोएसिटेटाचें संश्लेशण तिगोवन दवरता अशें मानतात हें लक्षांत घेवपासारकें आसा (34). पूण मेंदवाच्या ऊतकांक (जंय धमनीकाठिन्य मुखेलपणान एस्ट्रोसायटींमेरेन मर्यादीत आसता अशें मानतात) ह्या यंत्रणेची शारिरीक प्रासंगिकताय अजूनय म्हत्वाचें शारिरीक म्हत्व आसा (43). ह्या प्रकरणांत आमच्या डेटा प्रमाण कुडींतल्या ऑक्सफॉसाक लागून इबाडिल्ल्या पीएनांक बीसीएए विघटन आनी पायरुव्हेट कार्बोक्झीलेशनांत बदलूं येता, जे टीसीए पूल मध्यवर्ती पदार्थांच्या पूरक पदार्थांचे दोन मुखेल स्रोत आसात. तंत्रिका कोशिकांच्या ऊर्जा चयापचयांत बीसीएए चयापचयाचें अनुमानीत योगदान जरी सुचयलां तरी तंत्रिका संप्रेषणाक ग्लुटामेट आनी जीएबीए हांची भुमिका सोडल्यार (44) ह्या यंत्रणेविशीं अजूनय विव्हो हातूंत पुरावे मेळूंक नात. देखून अकार्यक्षम पीएन धमनीकाठिन्य वाडोवन आत्मसात करपाचे प्रक्रियेन चालना दिल्ल्या टीसीए मध्यवर्ती पदार्थांच्या सेवनाची भरपाय आपोआप करूंक शकतात असो अदमास काडप सोंपें. खासा करून अॅस्पार्टिक आम्लाची वाडिल्ली मागणी तिगोवन दवरपाखातीर पीसीएक्सचें अपरेग्युलेशन करपाची गरज आसूं येता, जी मायटोकॉंड्रियल विकृतताय आशिल्ल्या प्रसारीत पेशींत सुचयतात (45). पूण आमच्या मेटाबोलोमिक्स विश्लेशणांत Mfn2cKO PNs (आकृती S6A) हातूंतल्या अॅस्पार्टिक आम्लाच्या स्थिर अवस्थेच्या पातळेंत कसलोच म्हत्वाचो बदल दिसूंक ना, जो प्रसारीत पेशी आनी मायटोटिक उपरांतच्या तंत्रिका कोशिकांमदीं अॅस्पार्टिक आम्लाच्या वेगवेगळ्या चयापचयाच्या वापराचें प्रतिबिंबीत करता अशें समजतात . जरी विव्होंत अकार्यक्षम तंत्रिका कोशिकांतल्या पीसीएक्स अपरेग्युलेशनाची अचूक यंत्रणा अजून वळखुपाक उरली तरी हो अकाली प्रतिसाद तंत्रिका कोशिकांची रेडॉक्स स्थिती सांबाळपाक म्हत्वाची भुमिका करता हें आमी दाखयलें, जें सेरेबॅलर स्लाइसांचेर केल्ल्या एफएलआयएम प्रयोगांत दाखयलें. खासा करून पीएन हांकां पीसीएक्स अप-रेग्युलेट करपाक आडायल्यार चड ऑक्सिडीभवन स्थिती निर्माण जावंक शकता आनी कोशिकांचें मरण बेगीन जावंक शकता. बीसीएए विघटनाची सक्रियता आनी पायरुव्हेटाचें कार्बोक्झीलेशन हे मायटोकॉंड्रियल विकृतीच्या परिधीय ऊतकांचें लक्षणीकरण करपाचे मार्ग न्हय (7). देखून तीं ऑक्सफोस-उणाव आशिल्ल्या तंत्रिका कोशिकांचें एक प्राधान्य खाशेलपण अशें दिसता, जरी तें एकूच खाशेलपण नासलें तरी, जें तंत्रिका क्षयरोगाखातीर म्हत्वाचें आसता. .
सेरेबॅलर रोग हो एक विषम प्रकारचो तंत्रिका विकृत रोग आसून तो चड करून अॅटॅक्सिया म्हणून दिसून येता आनी चड करून पीएनांचें लुकसाण करता (46). ही तंत्रिका कोशिकांची लोकसंख्या मायटोकॉंड्रियल विकृततायेक खासा असुरक्षित आसता कारण मुयांमदीं तांचें निवडक क्षय मनशाच्या स्पाइनोसेरिबेलर अॅटॅक्सियाचें खाशेलपण आशिल्लीं जायतीं मोटर लक्षणां परतून तयार करपाक पुरो जाता (16, 47, 48). अहवालांप्रमाण उत्परिवर्तित जीन आशिल्ल्या ट्रान्सजेनिक मुयाच्या मॉडेलाचो संबंद मनशाच्या स्पाइनोसेरिबेलर अॅटॅक्सियाकडेन आसता आनी तातूंत मायटोकॉंड्रियल विकृतताय आसता (49, 50), पीएनपीएचांतल्या ऑक्सफोस उणावाच्या परिणामांचो अभ्यास करपाचेर भर दिला. देखून ही खाशेली तंत्रिका कोशिका लोकसंख्येची प्रभावीपणान वेगळी करप आनी ताचो अभ्यास करप खासा उपेगी पडटा. पूण पीएन दाबाकडेन खूब संवेदनशील आसतात आनी पुराय मस्तिष्ककोशिक पेशी लोकसंख्येचें उणें प्रमाण आसता हें मतींत घेतल्यार जायत्या ओमिक्साचेर आदारिल्ल्या अभ्यासाखातीर पुराय पेशी म्हूण तांचें निवडक वेगळेपण अजूनय एक आव्हानात्मक आंग आसा. हेर पेशी प्रकारांचो (खास करून प्रौढ ऊतकांत) दूषिततायेचो पूर्ण उणाव साध्य करप जवळजवळ अशक्य आसलें तरी आमी FACS कडेन एक प्रभावी विच्छेदन पावल एकठांय करून सकयल प्रवाहांतल्या प्रोटीओमिक्स विश्लेशणाखातीर फावो त्या प्रमाणांत जिवीत तंत्रिका कोशिका मेळयली, आनी पुराय मस्तिष्ककोशाच्या सद्याच्या डेटा संचांतल्या तुळेंत प्रथिनांचें प्रमाण सामकें चड (सुमार 3000 प्रथिनां) आसा (51). पुराय पेशींची जिवीतक्षमता सांबाळून आमी हांगा दिल्ले पद्दतीन मायटोकॉंड्रियांतल्या चयापचयाच्या मार्गांतले बदल तपासूंकच न्हय तर ताच्या सायटोप्लाझ्मीक समकक्षांत जावपी बदल तपासूंक मेळटात, जें कोशिका प्रकार समृध्द करपाखातीर मायटोकॉंड्रियल पड्ड्याच्या टॅगांच्या वापराक पूरक आसता जटिल ऊतकांतल्या मायटोकॉंड्रियाच्या संख्येखातीर नवी पद्दत (52, 53). आमी वर्णन केल्ली पद्दत फकत पुर्किन्जे पेशींच्या अभ्यासाकडेन संबंदीत ना, पूण मायटोकॉंड्रियल विकृतीच्या हेर मॉडेलां सयत दुयेंत मेंदवांतल्या चयापचयांतल्या बदलांक तोंड दिवपाखातीर खंयच्याय प्रकारच्या पेशींक सहजपणान लागू करूं येता.
निमाणें ह्या चयापचयाच्या पुनर्रचनेच्या प्रक्रियेंत आमी एक उपचारात्मक जनेलां वळखून घेतल्या जी कोशिकीय ताणाचीं मुखेल लक्षणां पुरायपणान उलटून तंत्रिका कोशिकांच्या क्षयरोगाक आळाबंदा हाडूंक शकता. देखून हांगा वर्णन केल्ल्या रिवायरींगाचे कार्यात्मक परिणाम समजून घेतल्यार मायटोकॉंड्रियल विकृतताये वेळार तंत्रिका कोशिकांची कार्यक्षमताय तिगोवन दवरपाखातीर शक्य आशिल्ल्या उपचारांविशीं मुळावी म्हायती मेळूं येता. हेर मेंदवाच्या पेशी प्रकारांतल्या ऊर्जा चयापचयांतल्या बदलांचें विच्छेदन करपाचो हेतू आशिल्ल्या फुडल्या संशोधनाची गरज आसा, जाका लागून हेर तंत्रिका रोगांक हें तत्व लागू जावपाची शक्यताय पुरायपणान उक्ती जाता.
मायटोपार्क मुयाचें वर्णन हाचेपयलीं केलां (31). loxP फ्लॅंकिंग Mfn2 जनुक आशिल्ल्या C57BL/6N मुयांचें वर्णन पयलीं केलां (18) आनी L7-Cre मुयांकडेन संकरीत केलां (23). उपरांत मेळिल्ल्या दुप्पट विषमयुग्मज संततीचें समसंयुग Mfn2loxP/Mfn2loxP मुयांवांगडा संकर करून Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) खातीर पुर्किन्जे-विशिश्ट जीन नॉकआउट तयार केलें. संभोगाच्या उपसमुहांत अतिरिक्त संकरांतल्यान Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) हाडलो (20). सगळ्यो जनावरांची प्रक्रिया युरोपीय, राश्ट्रीय आनी संस्थांच्या मार्गदर्शक तत्वांप्रमाण केल्ल्यो आनी जर्मनींतल्या उत्तर रायन-वेस्टफॅलियांतल्या उमवेल्ट आनी व्हरब्राउचरशुट्झ हांगाच्या लँडेसामटफुर्नॅटर कंपनीन मान्यताय दिली. तशेंच युरोपियन फेडरेशन ऑफ लॅबोरेटरी एनिमल सायन्सेस असोसिएशन्साच्या मार्गदर्शनाप्रमाण जनावरांचें काम जाता.
गुरवार बायलेच्या गर्भाशयाच्या विक्षेपाक बेशुध्द केल्या उपरांत मुयाचो भ्रूण वेगळो करतात (E13). 10 मिमी.हेपेस पुरवण केल्ल्या हॅन्क्साच्या बॅलेन्सड सॉल्ट सोल्युशनांत (HBSS) कॉर्टेक्साचें विच्छेदन करून पॅपेन (20 U/ml) आनी सिस्टीन (1μg/ml) आशिल्ल्या डल्बेकोच्या मॉडिफायड ईगल माध्यमाचेर धाडलें. ऊतक डीएमईएमांत उबें करप) आनी एन्झायमीक पचन करून ताचें विच्छेदन करप. एमएल) ३७ सॅ. प्रति ६ सेंमी.संवर्धन डिशांत २×१०६ घनतेचेर वा ०.५×१०५ पेशी/सेंमी.२ घनतेचेर पॉलीलायसीन लेप दिल्ल्या कंवचेच्या आवरणपट्ट्यांचेर प्रतिमा विश्लेशणाखातीर पेशींची बीं घालताले. ४ वरां उपरांत ह्या माध्यमाचे सुवातेर १% बी२७ पूरक आनी ०.५ मिमी.ग्लुटामॅक्स आशिल्लें न्यूरोबेसल सीरम मुक्त माध्यम घालें. उपरांत पुराय प्रयोगांत तंत्रिका कोशिका ३७ सॅ. आंतकड्यांनी पुनर्संयोजन प्रेरीत करपाखातीर दुसर् या दिसा आंगांतल्यान तंत्रिका कोशिकांचेर उपचार करपाखातीर सकयल दिल्ल्या एएव्ही९ व्हायरस वाहकाचें ३μl (२४ कुंड्याचें संवर्धन डिश) वा ०.५μl (२४ कुंड्याचें प्लेट) वापरलें: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, कॅटलॉग क्रमांक 105530-AAV9) आनी AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, कॅटलॉग क्रमांक 105545-AAV9) हीं नांवां मेळटात.
मुयाचें Mfn1 आनी Mfn2 पूरक डीएनए (अनुक्रमान Addgene प्लाझ्मीड #23212 आनी #23213 कडल्यान मेळिल्लें) C-अंतराचेर V5 क्रमांकान (GKPIPNPLLGLDST) चिन्नीत केल्लें आसता आनी T2A क्रमांतल्यान फ्रेमांत mCherry कडेन विलीन जाता. Grx1-roGFP2 ही हाइडलबर्ग टीपी डिक डीएफकेझेड (ड्यूचेस क्रेब्सफोर्शंगझेन्ट्रम) हाचें भेटवस्तू आसा. परंपरीक क्लोनिंग पद्दतीचो उपेग करून tdTomato कॅसेट बदलून कॅसेटीक pAAV-CAG-FLEX-tdTomato फाटीच्या कण्यांत (Addgene संदर्भ क्रमांक 28306) उपक्लोन करून pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 आनी pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 वाहक. अशीच रणनीती वापरून नियंत्रण वाहक pAAV-CAG-FLEX-mCherry तयार केल्ली. एएव्ही-शपीसीएक्स रचना तयार करपाखातीर प्लाझ्मीड एएव्ही व्हॅक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) गरजेचो आसता, तातूंत मुयाच्या पीसीएक्साक लक्ष्य करपी shRNA (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG) shRNA चो संकेत करपी डीएनए क्रम आसता ३′) U6 प्रवर्तकाच्या नियंत्रणाखाला mCherry CMV प्रवर्तकाच्या नियंत्रणाखाला वापरतात. सहाय्यक एएव्ही व्हॅक्टरांचें उत्पादन निर्मात्याच्या सुचोवण्यांप्रमाण (सेल बायोलॅब्स) केलें. थोडयाच उतरांनी, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) क्षणिकपणान 293AAV पेशींचें संक्रमण-T2A-MFN1-V5), mCherry व्हरपी हस्तांतरण प्लाझ्मीड वापरात (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) वा Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, तशेंच AAV1 कॅप्सिड प्रथिन आनी सहाय्यक प्रथिन कोडिंग पॅकेजिंग प्लाझ्मीड प्लाझ्मीड, कॅल्शियम फॉस्फेट पद्दत वापरून. कच्चो व्हायरस सुपरनॅटॅंट सुक्या बर्फ/इथेनॉल न्हाणांत गोठण-वितळप चक्रांवरवीं आनी फॉस्फेट बफर केल्ल्या खारें (PBS) हातूंत लायझ केल्लीं पेशी मेळयलीं. एएव्ही वाहक विच्छेदीत आयोडिक्सानॉल ग्रेडियेंट अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशन (32,000 आरपीएम आनी 4 सॅ. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX चो जीनोम टायटर पयलीं वर्णन केल्लेप्रमाण (54) आशिल्लो, रियल-टायम परिमाणात्मक पीसीआर (qPCR) वरवीं मेजलो. -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) आनी AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml) हीं द्रव्यां.
प्राथमिक तंत्रिका कोशिका बर्फाच्या थंड 1x पीबीएसांत कुस्करून काडून गुळयो घालून उपरांत फॉस्फेटॅज आनी प्रोटीज इन्हिबिटर (Roche) आशिल्ल्या 0.5% ट्रायटन एक्स-100 / 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोलेट/पीबीएस लायसिस बफरांत एकजीवीकरण केलें. बाइसिन्कोनिनिक आम्ल परीक्षण (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) वापरून प्रथिनांचे प्रमाणीकरण केलें. उपरांत एसडीएस-पॉलीऍक्रेलामायड जेल विद्युत् संचलन पद्दतीन प्रथिनां वेगळीं केल्लीं, आनी उपरांत पॉलीव्हिनिलिडीन फ्लोराइड पड्ड्याचेर (जीई हेल्थकेअर) ब्लॉट केलीं. अविशिश्ट सुवाती आडावप आनी टीबीएसटींत (Tris-buffered saline with Tween) 5% दुदांत प्राथमिक प्रतिपिंड (तपशीलां खातीर पळयात कोश्टक S1) घेवन, धुवपाच्यो पावलां आनी टीबीएसटी उब्या करपांत दुय्यम प्रतिपिंड उब्यो करप. प्राथमिक प्रतिपिंडावांगडा रातभर +४ सॅ. धुवन घेतकच दुय्यम प्रतिपिंड 2 वरां कोठारांतल्या तापमानांत लावचें. उपरांत त्याच ब्लॉटाक अँटी-बीटा-ऍक्टिन प्रतिपिंड उब्यो करून तेच भाराची खात्री जाली. रसायनीक प्रकाशांत रुपांतर करून आनी रसायन प्रकाश वाडोवन (जीई हेल्थकेअर) सोदून काडप.
कंवचेच्या कव्हरस्लिपाचेर पयलीं बीं घालून दवरिल्ल्या तंत्रिका कोशिकांक 4% पॅराफॉर्मॅलडायहायड (PFA)/PBS हें द्रव्यान थारायिल्ल्या वेळार कोठारांतल्या तापमानांत 10 मिनटां स्थिर केल्ले. कव्हरस्लिपांत पयलीं ०.१% ट्रायटन एक्स-१००/पीबीएस हें द्रव्य कोठारांतल्या तापमानांत ५ मिनटां, आनी उपरांत ब्लॉकिंग बफरांत [३% बोवाइन सीरम आल्बुमिन (बीएसए)/पीबीएस] घालतात. दुसर् या दिसा कव्हरस्लिप ब्लॉकिंग बफरान धुवन फावो त्या फ्लुओरोफोर-संयुजीत दुय्यम प्रतिपिंडावांगडा कोठारांतल्या तापमानांत २ वरां उब्यो दवरल्यो; निमाणें नमुने पीबीएसांत 4′,6-डायमिडिनो-2 -फेनिलिंडोल (DAPI) हें प्रतिरंग करून बरे तरेन धुवन उपरांत एक्वा-पॉली/माउंट हें सूक्ष्मदर्शक स्लाइडीचेर स्थिर केल्ले.
मुयांक (नर आनी मादी) केटामाइन (१३० मिग्रॅ/किग्रॅ) आनी सायलाझीन (१० मिग्रॅ/किग्रॅ) हांची पेरिटोनियल इंजेक्शन दिवन बेशुध्द करून कार्प्रोफेन वेदनाशामक (५ मिग्रॅ/किग्रॅ) हें वखद चमड्यापोंदा घालून उबदार पॅड आशिल्ल्या स्टीरियोटॅक्टिक उपकरणांत (Kopf) दवरले. कवटी उक्ती करून दंत ड्रिल वापरून मिस हाडाक अनुरूप आशिल्लो सेरेबॅलर कॉर्टेक्सचो भाग पातळ करचो (लॅम्ब्डा कडल्यान: शेंपडी १.८, बाजू १, चवथ्या आनी पांचव्या लोब्युलांक अनुरूप). वक्र सिरिंज सुयेचो उपेग करून कवटींत बारीकसाणेन ल्हान बुराक तयार करचो, जाका लागून सकयल आशिल्ल्या नाडी तंत्रांत व्यत्यय येवचो न्हय. उपरांत पातळ काडिल्ली कंवचेची केशिका ल्हव ल्हव सूक्ष्म बुराकांत (डुरा मेटराच्या उदराचे वटेन -१.३ ते -१) घालतात आनी १० ते २० मिनटांच्या जनेलाच्या काळांत हाताच्या सिरिंजांनी (नारिशिगे) 200 ते 300 एनएल एएव्ही मायक्रो-इंजेक्टरांत (नारिशिगे) जायते फावट उण्या दाबांत इंजेक्शन दितात. इंफ्युजन केल्या उपरांत केशिका आनीक 10 मिनटां दवरून व्हायरस पुरायपणान पातळूंक मेळचो. केशिका काडल्या उपरांत जखमेचो दाह उणो जावचो आनी जनावराक बरे जावपाक मेळचो म्हूण कातीचेर बारीकसाणेन शिंवरतात. शस्त्रक्रिया उपरांत जायते दीस जनावरांचेर वेदनाशामक वखदां (कॅस्पोफेन) दिवन उपचार केल्ले, त्या काळांत तांची शारिरीक स्थिती बारीकसाणेन पळयताले आनी उपरांत सांगिल्ल्या वेळार तांकां मरण आयलें. सगळ्यो कार्यपद्दती युरोपीय, राश्ट्रीय आनी संस्थांच्या मार्गदर्शक तत्वांप्रमाण केल्ल्यो आनी जर्मनींतल्या उत्तर रायन-वेस्टफॅलियांतल्या उमवेल्ट आनी व्हरब्राउचरशुट्झ हांगाच्या लँडेसामटफुर्नॅटर कंपनीन मान्यताय दिली.
जनावरांक केटामाइन (100 मिग्रॅ/किग्रॅ) आनी सायलाझीन (10 मिग्रॅ/किग्रॅ) हांणी बेशुध्द करून काळजाक पयलीं 0.1 एम पीबीएस, आनी उपरांत पीबीएसांत 4% पीएफए ​​घालून दिले. ऊतकाचे विच्छेदन करून ४% पीएफए/पीबीएसांत रातभर ४ सॅ. पीबीएसांतल्या स्थिर मेंदवापसून धनुर्धर विभाग (50 मायक्रोन जाड) तयार करपाखातीर कंपन करपी सुरी (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) वापरली. हेर तरेन सांगले बगर मुक्त तरंगपी विभागांचेर वयर वर्णन केल्लेप्रमाण (13) कोठारांतल्या तापमानांत आनी हालोवन रंगोवप जातालें. थोडयाच उतरांनी पयलीं मेळिल्ल्या कातड्यांचें ०.५% ट्रायटन एक्स-१००/पीबीएस हें द्रव्य कोठारांतल्या तापमानांत १५ मिनटां पारगम्यीकरण केलें; कांय एपिटोप (Pcx आनी Shmt2) खातीर, ८० सॅ. उपरांत विभागांक प्राथमिक प्रतिपिंड (पळयात कोश्टक S1) आडावपी बफरांत (3% BSA/PBS) 4 सॅ.तापमानाचेर रातभर हालोवन दवरले. दुसऱ्या दिसा विभाग ब्लॉकिंग बफरान धुवन फावो त्या फ्लुओरोफोर-संयुजीत दुय्यम प्रतिपिंडांत 2 वरां कोठारांतल्या तापमानांत उब्यो दवरल्यो; निमाणें विभाग पीबीएसांत बरे तरेन धुवन डीएपीआय हांणी प्रतिरंग करून उपरांत एक्वापॉलीमाउंट ऑन मायक्रोस्कोप स्लाइडान स्थिर केल्ले.
नमुन्याची प्रतिमा तयार करपाखातीर धव्या उजवाडाचो लेसर आनी ४०५ डायोड पराबैंगनी लेसर आशिल्लो लेसर स्कॅनिंग कॉनफोकल मायक्रोस्कोप (TCS SP8-X वा TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) वापरलो. फ्ल्युओरोफोर उत्तेजीत करून आनी संकरीत डिटेक्टर (HyDs) ह्या यंत्रान संकेत एकठांय करून क्रमीक पद्दतीन नायक्विस्ट नमुन्याक अनुरूप आशिल्लीं रांकीत प्रतिमा एकठांय करपाखातीर LAS-X सॉफ्टवेअराचो उपेग केलो: बिगर परिमाणात्मक पॅनलाखातीर तो अत्यंत गतिशील संकेत (देखीक- दैहिक कोशिकांत आनी डेंड्रायटांत) mtYFP) ब्राइटआर मोडांतल्या पीएनांची संख्या सोदून काडपाखातीर HyD वापरात). पार्श्वभूंय उणी करपाखातीर ०.३ ते ६ ns मेरेन गेटींग करतात.
क्रमवारीत केल्ल्या कोशिकांची रियल-टायम प्रतिमा तयार करप. १% बी२७ पूरक आनी ०.५ मिमी. धवो लेसर, HyD, 63×[1.4 संख्यात्मक रंध्र (NA)] तेल ऑब्जॅक्टिव्ह भिंग आनी तापवणी स्टेज आशिल्ल्या लायका एसपी8 लेसर स्कॅनिंग कॉनफोकल मायक्रोस्कोपाचेर रियल-टायम इमेजिंग केलें.
मुयाचें रोखडेंच कार्बन डाय-ऑक्सायडान बेशुध्द करून ताची तकली कापून उडयली, मेंदू रोखडोच कवटींतल्यान काडून 200μm जाड (13C लेबलिंग प्रयोगाखातीर) वा 275μm जाड (दोन फोटॉन प्रयोगांखातीर) धनुर्धर विभागांत कापून सकयल दिल्ल्या पदार्थांनी भरलो The ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) तातूंत फुडले पदार्थ भरतात: १२५ मिमी.बरफ थंड, कार्बन संतृप्त (९५% O2 आनी ५% CO2) उण्या प्रमाणांत Ca2 + कृत्रीम मस्तिष्कमेरुरज्जू द्रव (ACSF) NaCl, २.५ मिमी.केसीएल, १.२५ मिमी.सोडियम फॉस्फेट बफर, २५ मिमी.नाएचसीओ३, २५ मिमी.ग्लुकोज, ०.५ मिमी ३.५ मिमी.MgCl2 (३१० ते ३३० मिमोल इतलो आसमाटिक दाब). मेळिल्ले मेंदवाचे कातडे चड Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHCO3, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl2 आनी 2.0 mM MgCl2) आशिल्ल्या उब्या करचे पयलींच्या कोठयेंत हस्तांतरीत करात. मध्यम) पीएच ७.४ आनी ३१० ते ३२० मिमोल).
प्रतिमा प्रक्रिया करतना कातडीं समर्पीत प्रतिमा कक्षांत व्हरून ३२° ते ३३ सॅ. स्लाइस इमेजिंग करपाखातीर लायका २५x ऑब्जेक्टिव्ह लेन्स (NA 0.95, उदक), Ti: Sapphire लेसर (Chameleon Vision II, Coherent) हांणी सज्ज आशिल्लो मल्टीफोटोन लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) वापरलो. FLIM मॉड्यूल (पिकोहार्प300, पिकोक्वांट).
Grx1-roGFP2 चें FLIM. पीएनच्या सायटोप्लाझ्मीक रेडॉक्स स्थितींतले बदल सॅजिटल मेंदवाच्या कातड्यांनी दोन फोटॉन एफएलआयएम पद्दतीन मेजले, जंय Grx1-roGFP2 जैवसंवेदक पीएनांक लक्ष्य करतालो. पीएन थरांत स्लाइस पृश्ठासकयल सुमार ५० ते ८० मायक्रोन अंतराचेर संपादन क्षेत्र वेंचून काडटात, जाका लागून एक कार्यक्षम पीएन (म्हळ्यार डेंड्रायटांभोंवतणी मणी आशिल्ली संरचना वा तंत्रिका कोशिकांच्या आकारिकीचे बदलाचो उणाव) आनी दुप्पट पॉझिटिव्ह roGFP2 संवेदक आनी एएव्ही एन्कोडिंग shRNA PCx वा ताचो नियंत्रण क्रम (दरेक सह-अभिव्यक्त करपी mCherry) आसा हाची खात्री करतात. 2x डिजिटल झूम [उत्तेजन तरंगलांबाय: 890 एनएम; ५१२ एनएम ५१२ पिक्सेल]. सोद: वक्र फिटिंग करपाखातीर फावो ते फोटॉन (वट्ट 1000 फोटॉन) एकठांय करपाची खात्री करपाखातीर अंतर्गत HyD, फ्ल्युओरेसेन आयसोथियोसायनेट (FITC) फिल्टर गट] आनी 2 ते 3 मिनटांभितर प्रतिमा सरासरी करपाचो उपेग करतात. Grx1-roGFP2 संशोधनाची संवेदनशीलता आनी FLIM परिस्थितीचें सत्यापन, परफ्यूजन ACSF हातूंत बाह्यजनन 10 mM H2O2 घालतना (ऑक्सिडीभवन चडांत चड करपाखातीर, ताका लागून आयुश्य वाडटा), आनी मागीर 2 mM डायथियोथ्रायटोल घालून (उणें करपाची मापां उणी जाता, ताका लागून उणें जाता) घालून roGFP2 च्या आयुश्य मोलाचेर नियंत्रण दवरून केलें आयुश्यांत) (आकृती S8, D ते G). मेळिल्ल्या परिणामांचें विश्लेशण करपाखातीर FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेअर वापरात, पुराय प्रतिमेचो एकूच घातीय क्षय वक्र मेजपाच्या आयआरएफ (इंस्ट्रुमेंट रिस्पॉन्स फंक्शन) कडेन फिट करचो आनी χ2 सुमार 1. एकाच पीएनचो आयुश्य मेजपाखातीर तंत्रिका कुडी भोंवतणचो मास्क हाताळणीन काडलो आनी दर एका मास्कांतलो सरासरी आयुश्य प्रमाणीकरणाखातीर वापरलो.
मायटोकॉंड्रियल संभाव्य विश्लेशण. तीव्र विभाग 100 एनएम टीएमआरएम थेट परफ्यूज केल्ल्या एसीएसएफांत घालून 30 मिनटां उब्या केल्या उपरांत पीएनांचे मायटोकॉंड्रियल विभवांत बदल दोन फोटॉन सूक्ष्मदर्शकावरवीं मेजले. ९२० एनएमचेर संशोधनाक उत्तेजन दिवन आनी संकेत एकठांय करपाखातीर अंतर्गत हायडी (टेट्रामिथिलरोडामाइन आयसोथियोसायनेट: ५८५/४० एनएम) वापरून टीएमआरएम प्रतिमा तयार केली; समान उत्तेजन तरंगलांबाय वापरून पूण वेगळो अंतर्गत HyD (FITC :525/50) वापरून mtYFP प्रतिमा तयार करून. एकेच कोशिकेच्या पांवड्यार मायटोकॉंड्रियल क्षमतायचें मुल्यांकन करपाक ImageJ च्या Image Calculator प्लग-इन वापरात. थोडयाच उतरांनी सांगपाचें जाल्यार प्लग-इन समीकरण: signal = min (mtYFP, TMRM) वापरून संबंदीत चॅनलाच्या एकेच स्टॅक कॉनफोकल प्रतिमेंत पुर्किन्जे सोमाली भाशेंत टीएमआरएम संकेत दाखोवपी मायटोकॉंड्रियल प्रदेश वळखतात. उपरांत मेळिल्ल्या मास्कांतल्या पिक्सेल क्षेत्रफळाचें प्रमाण थारायतात, आनी उपरांत mtYFP चॅनलाच्या संबंदीत थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टॅक प्रतिमेचेर सामान्यीकरण करून मायटोकॉंड्रियल क्षमता दाखोवपी मायटोकॉंड्रियल अंश मेळयतात.
ह्युजेन्स प्रो (सायन्टिफिक व्हॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेअरान प्रतिमेचें डिकॉन्व्होल्युट केल्लें. टायल्साच्या स्कॅन केल्ल्या चित्रांखातीर लास-एक्स सॉफ्टवेअरान दिल्ल्या स्वयंचलीत शिंवपाच्या आल्गोरिदमाचो उपेग करून एकाच टायल्सचो मोंटाज करतात. प्रतिमा मापांकन केल्या उपरांत, प्रतिमेचेर आनीक प्रक्रिया करपाक आनी एकसारको उजवाड आनी विपरीतताय समायोजीत करपाक ImageJ आनी Adobe Photoshop वापरात. ग्राफिक तयारी खातीर Adobe Illustrator वापरात.
mtDNA फोकस विश्लेशण. डीएनए आड प्रतिपिंडांनी लेबल केल्ल्या सेरेबॅलर विभागांचेर कॉनफोकल मायक्रोस्कोपावरवीं mtDNA घायांची संख्या मेजली. दरेक लक्ष्य क्षेत्र कोशिक कुडीखातीर आनी दर एका कोशिकेच्या केंद्रकाखातीर तयार केल्लो आनी मल्टी मेजर प्लग-इन (ImageJ सॉफ्टवेअर) वापरून त्या त्या क्षेत्रफळाची गणना केल्ली. कोशिका कुडीच्या क्षेत्रांतल्यान अणुकेंद्रीय क्षेत्र वजा करून कोशिकाद्रव्य क्षेत्र मेळोवचें. निमाणें, थ्रेशोल्ड प्रतिमेचेर mtDNA दाखोवपी सायटोप्लाझ्मीक डीएनए बिंदू आपोआप प्रमाणीत करपाखातीर अॅनालायझ पार्टिकल्स प्लग-इन (ImageJ सॉफ्टवेअर) वापरून मेळिल्ले परिणाम सीटीआरएल मुयाच्या पीएन सरासरीमेरेन सामान्य केल्ले. परिणाम दर कोशिकेक सरासरी न्यूक्लिओसाइडांची संख्या अशें दर्शयतात.
प्रथिन अभिव्यक्तीचें विश्लेशण. एकेच कोशिका पातळेचेर पीएनांतल्या प्रथिन अभिव्यक्तीचें मुल्यांकन करपाक ImageJ च्या Image Calculator प्लग-इन वापरात. थोडयाच उतरांनी सांगपाचें जाल्यार संबंदीत वाहिनीच्या एकेच थराचे संकेंद्रीय प्रतिमेंत: संकेत = min (mtYFP, प्रतिपिंड) ह्या समीकरणावरवीं पुर्किनांतल्या एका खाशेल्या प्रतिपिंडाचेर प्रतिकारशक्ती दाखोवपी मायटोकॉंड्रियल प्रदेश वळखतात. उपरांत मेळिल्ल्या मास्कांतल्या पिक्सेल क्षेत्रफळाचें प्रमाण थारायतात, आनी मागीर mtYFP चॅनलाच्या संबंदीत थ्रेशोल्ड सिंगल-स्टॅक प्रतिमेचेर सामान्यीकरण करून दाखयल्ल्या प्रथिनाचो मायटोकॉंड्रियल अंश मेळयतात.
पुर्किन्जे कोशिका घनताय विश्लेशण. इमेजजेच्या सेल काउंटर प्लग-इनचो उपेग करून मेजल्ल्या पुर्किन्जे पेशींची संख्या मेजपाच्या कोशिकांनी व्यापिल्ल्या मस्तिष्ककोशिकाच्या वलयाचे लांबायेन भागून पुर्किन्जे घनतेचें मुल्यांकन केलें.
नमुने तयार करप आनी एकठांय करप. नियंत्रण गटांतल्या आनी Mfn2cKO मुयांचो मेंदू ०.१ एम फॉस्फेट बफरांत (पीबी) २% पीएफए/२.५% ग्लुटारॅलडीहायडांत स्थिर केलो आनी उपरांत सिलिएट्स (लेइका मायक्रोसिस्टम जीएमबीएच, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) (दाटाय ५० ते ६० मायक्रोन) वापरून कोरोनल विभाग तयार केले उपरांत १% ऑस् टेट्राऑक्सायडांत पीबी बफरांत स्थिर करून आनी १.५% पोटॅशियम फेरोसायनायड कोठारांतल्या तापमानांत १ वरां. विभाग डिस्टिल्ड उदकान तीन फावटीं धुवन, उपरांत 1% युरेनिल ऍसिटेट आशिल्ल्या 70% इथेनॉलान 20 मिनटां रंगयले. उपरांत विभागांक ग्रेड केल्ल्या आल्कोहॉलांत निर्जलीकरण करून सिलिकॉन लेप आशिल्ल्या कंवचेच्या स्लाइडींमदीं दुरकुपन एसीएम (Araldite casting resin M) इपॉक्सी रेझीन (Electron Microscopy Sciences, catalog number 14040) हातूंत घालून निमाणें 60° से. सेरेबॅलर कॉर्टेक्सचो वाठार वेंचून लायका अल्ट्राकट (लेइका मायक्रोसिस्टम जीएमबीएच, व्हिएन्ना, ऑस्ट्रिया) हाचेर ५० एनएम अतिपातळ विभाग कापून पॉलीस्टायरीन फिल्मान लेप दिल्ल्या २×१ मिमी. विभागांक H2O हातूंतल्या 4% युरेनिल ऍसिटेटाच्या विरयान 10 मिनटां रंगयले, H2O च्या आदारान जायते फावट धुवन, उपरांत H2O च्या रेनॉल्ड्स शिंशें सिट्रेटान 10 मिनटां धुवन उपरांत H2O च्या आदारान जायते फावट धुवन काडले. टीव्हीआयपीएस (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 डिजिटल कॅमेरो (TVIPS GmbH, Gauting, USA) वापरून संचरण इलॅक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शक फिलिप्स सीएम100 (थर्मो फिशर सायन्टिफिक, वाल्थम, एम.ए., अमेरिकेचीं संयुक्त संस्थानां) वापरून सूक्ष्मचित्र घेतले. जर्मनी).
एएव्ही संसर्ग जाल्ल्या मुयांखातीर मेंदू वेगळो करून १ मिमी.जाड धनुर्धर विभागांत कातरून, एएव्ही संसर्ग जाल्ली रिंग (म्हळ्यार mCherry expressing) वळखुपाखातीर प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शकाचो उपेग करून मस्तिष्ककोशाची तपासणी केली. फकत अशे प्रयोग वापरतात, जातूंत एएव्ही इंजेक्शनाक लागून पुर्किन्जे कोशिका थराची (म्हळ्यार चड करून पुराय थराची) उण्यांत उणी सलग दोन मस्तिष्ककोशांतल्या वलयांत खूब चड संप्रेषण कार्यक्षमताय मेळटा. एएव्ही-ट्रांसड्यूस्ड लूप रातभर स्थिरीकरणा उपरांत (०.१ एम कोकोएट बफरांत ४% पीएफए ​​आनी २.५% ग्लुटारॅलडीहायड) करपाखातीर सूक्ष्मविच्छेदन करून फुडली प्रक्रिया केली. ईपीओएन एम्बेडींग करपाखातीर स्थिर ऊतक ०.१ एम सोडियम कोकोएट बफर (Applichem) च्या आदारान धुवन, ०.१ एम सोडियम कोकोएट बफर (Applichem) हातूंत २% OsO4 (os, Science Services; Caco) च्या आदारान ४ वरां उबें दवरलें, उपरांत २ वरां धुवन घेतलें. ०.१ एम कोकॅमाइड बफरान ३ फावटीं परतून करचें. उपरांत इथेनॉलाची चडपी माळेचो उपेग करून दर एका इथेनॉलाच्या विरयाक ४ सॅ.तापमानाचेर १५ मिनटां दवरून ऊतक निर्जलीकरण केलें. ऊतक प्रोपिलीन ऑक्सायडांत घालून EPON (Sigma-Aldrich) हातूंत 4 सॅ. ताजें ईपीएनांत ऊतक कोठारांतल्या तापमानांत २ वरां दवरचें, आनी मागीर ६२ सॅ. अल्ट्रामायक्रोटोम (Leica Microsystems, UC6) आनी हिऱ्याची सुरी (Diatome, Biel, Switzerland) वापरून 70 एनएम अतिपातळ विभाग कापून, 1.5% युरेनिल ऍसिटेटान 15 मिनटां 37 सॅ. कॅमेरा वनव्यू ४के १६-बिट (गॅटन) आनी डिजिटलमायक्रोग्राफ सॉफ्टवेअर (गॅटन) हांणी सज्ज आशिल्ल्या जेईएम-२१०० प्लस ट्रांसमिशन इलॅक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (जेओएल) वापरून इलॅक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ घेतले. विश्लेशणाखातीर ५०००× वा १०,०००× डिजिटल झूम वापरून इलॅक्ट्रॉन मायक्रोग्राफ मेळयले.
मायटोकॉंड्रियाचें आकारिकीविज्ञानीक विश्लेशण. सगळ्या विश्लेशणांखातीर इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून डिजिटल प्रतिमांनी वैयक्तीक मायटोकॉंड्रियांची आकृती हाताळणी केल्ली. वेगवेगळ्या आकारिकी मापदंडांचें विश्लेशण करतात. दरेक कोशिकेच्या वट्ट मायटोकॉंड्रियल क्षेत्रफळाचें सायटोप्लाझ्मा क्षेत्रफळ (कोशिका क्षेत्रफळ-कोशिका केंद्रक क्षेत्रफळ) × 100 च्या आदारान विभागून मेळिल्ले टक्केवारी प्रमाण मायटोकॉंड्रियल घनताय दर्शयतात.मायटोकॉंड्रियलाची वाटकुळीताय [4π∙(क्षेत्रफळ/परिधि 2)] ह्या सूत्रान मेजतात. मायटोकॉंड्रियाच्या इस्ता आकृतीबंधाचें विश्लेशण करून तांच्या मुखेल आकाराप्रमाण दोन वर्ग (“नळयेभशेन” आनी “फोड”) केल्ले.
ऑटोफॅगोझोम/लायसोझोम संख्या आनी घनताय विश्लेशण. डिजिटल प्रतिमेंतल्या दर एका ऑटोफॅगोझोम/लायसोझोमाच्या आकृतीबंधाची हाताळणी करपाखातीर ImageJ सॉफ्टवेअर वापरात. दरेक कोशिकेच्या वट्ट ऑटोफॅगोझोम/लायसोझोम संरचनेच्या क्षेत्रफळाचें कोशिकाद्रव्य क्षेत्रफळ (कोशिकाद्रव्य क्षेत्र=कोशिक क्षेत्र-अणुकेंद्र क्षेत्र)×100 च्या भागान विभागून गणीत केल्ल्या टक्केवारी प्रमाण दर्शयतात. वट्ट संख्येक दर कोशिकेंतल्या ऑटोफॅगोझोम/लायसोझोम संरचनेच्या संख्येन (सायटोप्लाझ्मीक क्षेत्रफळाचे नदरेन) (सायटोप्लाझ्मीक क्षेत्रफळ = कोशिका क्षेत्रफळ-अणुकेंद्रीय क्षेत्रफळ) भाग करून ऑटोफॅगोझोम/लायसोझोमांची घनताय मेजतात.
तीव्र विभागणी आनी नमुनो तयार करपाखातीर लेबलिंग. ग्लुकोज लेबलिंगाची गरज आशिल्ल्या प्रयोगांखातीर मेंदवाच्यो तीव्र कातयो उब्या करचे पयलींच्या कोठयेंत हस्तांतरीत करचे, तातूंत संतृप्त कार्बन (95% O2 आनी 5% CO2), चड Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM आसता d-ग्लुकोज, १.० मिमी. CaCl २ आनी २.० मिमी. पायरुव्हेट लेबलिंगाची गरज आशिल्ल्या प्रयोगांखातीर मेंदवाच्यो तीव्र कातयो चड Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 आनी 2.0mM घालतात MgCl2, pH 7.4 आनी 310 ते 320mOsm मेरेन समायोजीत करप, आनी 1mM 1-[1-13C]पायरुव्हेट (Eurisotop, catalog number CLM-1082) घालचें. विभाग ३७ सॅ.तापमानाचेर ९० मिनटां उब्यो दवरतात. प्रयोगाच्या निमाणें ७५ मिमी.अमोनियम कार्बोनेट आशिल्ल्या उदकाच्या विरयान (पीएच ७.४) विभाग बेगीन धुवन उपरांत ४०:४०:२० (v:v:v) एसीटोनायट्रायल (ACN): मेथॅनॉल: उदकांत एकजीवीकरण केलें. विभाग बर्फाचेर ३० मिनटां दवरल्या उपरांत नमुन्यांचे ४ सॅ.तापमानाचेर १० मिनटां २१,००० ग्रॅ. तातूंतल्यान मेळपी सुकयल्ली चयापचयाची गोळी विश्लेशणामेरेन -८० सॅ.
13 सी-लेबल केल्ल्या अॅमिनो अॅसिडांचें द्रव वर्णपटलेखन-द्रव्यमान वर्णपटमापन विश्लेशण. द्रव वर्णपटलेखन-द्रव्यमान वर्णपटमापन (LC-MS) विश्लेशणाखातीर चयापचयाची गोळी ७५μl एलसी-एमएस ग्रेड उदकांत (हनीवेल) परतून स्थलांतरीत केली. ४ सॅ.तापमानाचेर २१,००० ग्रॅ. आदीं वर्णन केल्ल्या बेंझोयल क्लोरायड व्युत्पत्ती प्रोटोकॉल (55, 56) वापरून अॅमिनो अॅसिड विश्लेशण केलें. पयल्या पांवड्यांत २०μl चयापचयाच्या अर्कांत १०० मिमी. नमुन्याक थोडो वेळ भंवर घालून उपरांत २० सॅ.तापमानाचेर २१,००० ग्रॅ. निवळ केल्लें सुपरनॅटॅंट शंक्वाकार कंवचेच्या इन्सर्टान (200 μl खंड) 2 मिलिलीटर ऑटोसॅम्पलर शीशींत हस्तांतरीत करचें. क्यू-एक्सॅक्टिव्ह (क्यूई)-एचएफ (अल्ट्रा हाय फिल्ड ऑर्बिट्रॅप) उच्च रिझोल्यूशन सुक्ष्म द्रव्यमान वर्णपटमापक (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) कडेन जोडिल्ली ऍक्विटी आयक्लास अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स एलसी प्रणाली (वॉटर्स) वापरून नमुन्यांचे विश्लेशण केलें. विश्लेशणाखातीर व्युत्पन्न केल्ल्या नमुन्याचो २μl १.८μm कण आशिल्ल्या १००×१.० मिमी. प्रवाह दर १००μl/मिनिट आसता आनी बफर प्रणालींत बफर ए (उदकांत १० मिमी.अमोनियम फॉर्मेट आनी ०.१५% फॉर्मिक आम्ल) आनी बफर बी (ACN) हांचो आस्पाव जाता. ग्रेडियेंट असो आसता: ० मिनटांनी ०%B; ०% बी. ० ते १५% बी ० ते ०.१ मिनटांनी; ०.१ ते ०.५ मिनटांनी १५ ते १७% बी; बी ०.५ ते १४ मिनटांनी १७ ते ५५%; बी ५५ ते ७०% १४ ते १४.५ मिनटांनी; १८ मिनटांनी १४.५ ते ७० ते १००% बी; १८ ते १९ मिनटांनी १००% बी; १९ ते १९.१ मिनटांनी १०० ते ०% बी; १९.१ ते २८ मिनटां (५५, ५६) वेळार ०% बी. क्यूई-एचएफ द्रव्यमान वर्णपटमापक सकारात्मक आयनीकरण पद्दतींत काम करता आनी ताची द्रव्यमान श्रेणी m/z (द्रव्यमान/आभार प्रमाण) 50 ते 750 आसता.लागू केल्लो रिझोल्यूशन 60,000, आनी मेळिल्लो गेन कंट्रोल (AGC) आयन लक्ष्य 3×106 आनी चडांत चड आयन वेळ 100 मिलीसेकंद आसता. तापयल्लो विद्युत् फवारो आयनीकरण (ESI) स्त्रोत ३.५ केव्ही फवारो विद्युत्दाब, २५० सॅ. २५० सॅ. एस भिंग 60 एयूचेर सेट केल्लो आसता.
13C लेबल आशिल्ल्या कार्बनी अम्लांचें आयन वर्णपटलेखन-एमएस विश्लेशण. उरिल्ल्या चयापचयाच्या अवक्षेपाचें (55μl) विश्लेशण क्यूई-एचएफ द्रव्यमान वर्णपटमापकाक (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) जोडिल्ल्या डायोनेक्स आयन वर्णपटलेखन प्रणाली (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) वापरून केलें. थोडयाच उतरांनी सांगपाचें जाल्यार एचपीएलसी (2 मिमी×250 मिमी., कण आकार 4μm, थर्मो फिशर सायन्टिफिक) हांणी सज्ज आशिल्ल्या डायोनेक्स आयनपॅक एएस11-एचसी स्तंभांत 5μl चयापचयाचो अर्क 1. ) भरपाच्या प्रमाणांत पुश-इन आंशिक लूप मोडांत इंजेक्शन दिलो फिशर सायन्टिफिक). स्तंभाचें तापमान ३० सॅ., आनी ऑटोसॅम्पलर ६ सॅ. विआयनीकृत उदकान दिल्लें पोटॅशियम हायड्रॉक्सायड कार्टुज वापरून विरगळपी जनरेटरावरवीं पोटॅशियम हायड्रॉक्सायड ग्रेडियेंट तयार करचो. चयापचयद्रव्यां 380μl/min प्रवाह दरान वेगळे करप, सकयल दिल्लो ग्रेडियेंट लागू करप: 0 ते 3 मिनटां, 10 mM KOH; ३ ते १२ मिनटां, १० ते ५० मिमी. १२ ते १९ मिनटां, ५० ते १०० मिमी. १९ ते २१ मिनटां , १०० मिमी. २१ ते २१.५ मिनटां, १०० ते १० मिमी. स्तंभाक १० मिमी.केओएच खाला ८.५ मिनटां परतून समतोल केलो.
विरगळिल्ले चयापचय पदार्थ स्तंभा उपरांत १५०μl/min आयसोप्रोपानोल पूरक प्रवाहांत जोडटात आनी उपरांत नकारात्मक आयनीकरण पद्दतींत काम करपी उच्च रिझोल्यूशन द्रव्यमान वर्णपटमापकाचेर निर्देशीत करतात. एमएस 60,000 रिझोल्यूशनान m/z 50 ते 750 मेरेनच्या द्रव्यमानाच्या आवांठाचेर नियंत्रण दवरता. एजीसी 1×106 अशें थारायलां आनी चडांत चड आयन वेळ 100 एमएस दवरतात. तापयल्लो ईएसआय स्त्रोत ३.५ केव्ही फवारो विद्युत्दाबाचेर चलतालो. आयन स्त्रोताचीं हेर सेटिंग्ज अशीं- केशिका तापमान २७५ सॅ. म्यान वायू प्रवाह, 60 एयू; सहाय्यक वायूचो प्रवाह, 300 सॅ.तापमानाचेर 20 एयू आनी एस भिंग 60 अॅस.
13C लेबल आशिल्ल्या चयापचयाचें डेटा विश्लेशण. समस्थानिक प्रमाणाचें डेटा विश्लेशण करपाखातीर TraceFinder सॉफ्टवेअर (आवृत्ती 4.2, Thermo Fisher Scientific) वापरात. दर एका संयुगाची वळख विस्वासांत घेवपासारक्या संदर्भ संयुगान सत्यापीत करून स्वतंत्रपणान विश्लेशण केलें. समस्थानिक समृध्दी विश्लेशण करपाखातीर दर एका 13C समस्थानिकाच्या (Mn) काडिल्ल्या आयन वर्णपटलेखनाचो (XIC) क्षेत्रफळ [M + H] + हातूंतल्यान काडलो, जंय n हो लक्ष्य संयुगाचो कार्बन संख्या आसून, ताचो उपेग अॅमिनो अॅसिडांचें विश्लेशण करपाखातीर जाता वा [ MH] + वापरून आयनांचें विश्लेशण करतात. एक्सआयसीची द्रव्यमान अचूकता दर दशलक्षांत पांच भागांपरस उणी आसता आनी आरटीची अचूकता ०.०५ मिनटां आसता. दर एका मेळिल्ल्या समस्थानिकाचें आनी संबंदीत संयुगाच्या सगळ्या समस्थानिकांच्या बेरीजाचें प्रमाण मेजून समृध्दी विश्लेशण करतात. हे प्रमाण दर एका समस्थानिकाखातीर टक्केवारी मोल म्हणून दितात आनी ताचे परिणाम मोलर टक्के समृध्दी (MPE) अशें दाखयतात, अशें पयलीं वर्णन केलां (42).
गोठयल्ल्या तंत्रिका कोशिकांच्या गोळ्याक बर्फाच्या थंड ८०% मेथॅनॉलांत (v/v) एकजीव करून भंवर घालून -२० सॅ. नमुनो परतून भंवर करून +४ सॅ.तापमानाचेर ३० मिनटां हालोवप. नमुनो २१,००० ग्रॅम तापमानांत ४ सॅ.तापमानाचेर ५ मिनटां केंद्रोत्सारीत केलो आनी उपरांत मेळिल्लें सुपरनॅटॅंट एकठांय करून उपरांतचें विश्लेशण करपाखातीर २५ सॅ. वयर वर्णन केल्लेप्रमाण क्रमवारीत केल्ल्या पेशींच्या अॅमिनो अॅसिडांचेर एलसी-एमएस विश्लेशण केलें. ट्रेसफायंडर (आवृत्ती ४.२, थर्मो फिशर सायन्टिफिक) वापरून दर एका संयुगाच्या एकसमस्थानिक द्रव्यमानाच्या आदारान म्हायतीचें विश्लेशण केलें. चयापचयाच्या डेटाचें क्वांटायल सामान्यीकरण preprocessCore सॉफ्टवेअर पॅकेज वापरून केलें (57).
स्लाइस तयार करप. मुयाचें रोखडेंच कार्बन डाय-ऑक्सायडान बेशुध्द करून ताची तकली कापली, मेंदू रोखडोच कवटींतल्यान काडून उडयलो आनी बर्फान भरिल्ली कंपन करपी सुरी (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) वापरून ताका 300 ते 375 μm धनुष विभागांत कापून थंड कार्बन वायूरूपीकरण (95% O2 आनी 5% CO2) उणें केलें Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लुकोज, 1.0 mM CaCl2 आनी 6.0 mM MgCl2 pH 7.4 आनी 310 ते 330 mOsm मेरेन समायोजीत करचें). मेळिल्ले मेंदवाचे कातडे चड Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 आनी mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 आनी ३१० ते ३२० मिमी. रेकॉर्ड करचे पयलीं तीं परतून मेळचीं म्हणून 20 ते 30 मिनटां कातडी सांठोवचीं.
रेकॉर्डिंग करप. सगळ्या रेकॉर्डिंगांखातीर स्थिर रेकॉर्डिंग चेंबर आनी २०x उदकांत बुडोवपी ऑब्जॅक्टिव्ह लेन्स (Scientifica) आशिल्ली सूक्ष्मदर्शकाची अवस्था वापरली. (i) कुडीचो आकार, (ii) मस्तिष्ककोशाचें शरीररचनेचें स्थान आनी (iii) प्रतिदीप्त mtYFP रिपोर्टर जनुकाची अभिव्यक्ती हांचेवरवीं अनुमानीत पुर्किन्जे पेशी वळखून घेतलीं. ५ ते ११ मेगोहम टोक प्रतिकार आशिल्लो पॅच पिपेट बोरोसिलिकेट कंवचेच्या केशिका (जीबी१५०-१०, ०.८६ मिमी.×१.५ मिमी.×१०० मिमी., सायन्स प्रोडक्ट्स, होफहायम, जर्मनी) आनी आडव्या पिपेट इन्स्ट्रुमेंट्स (पी-१०००, सटर), नोवाटो, सीए हांणी काडटात. सगळ्यो रेकॉर्डिंग ELC-03XS npi पॅच क्लॅम्प एम्पलीफायर (npi electronic GmbH, Tam, Germany) ह्या यंत्रावरवीं केल्ल्यो, जाचेर सिग्नल सिग्नल (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) ह्या सॉफ्टवेअरान नियंत्रीत केल्लें. हो प्रयोग १२.५ किग्रॅ.हर्ट्झ नमुनो घेवपाच्या दरान नोंद केलो. संकेत अनुक्रमान १.३ आनी १० किग्रॅ.हर्ट्झ कटऑफ कंप्रताय आशिल्ल्या दोन शॉर्ट-पास बेसेल फिल्टरांनी गाळटात. पड्डो आनी पिपेट हांची धारकता प्रवर्धकाचो उपेग करून भरपाय मंडळावरवीं भरपाय करतात. सगळे प्रयोग होकावो सॉफ्टवेअर (आवृत्ती २.८, हामामात्सू, गेर्डन, जर्मनी) ह्या कॅमेऱ्याच्या नियंत्रणाखाला ऑर्का-फ्लॅश ४.० कॅमेऱ्याच्या नियंत्रणाखाला केल्ले (हामामात्सु, गेर्डन, जर्मनी).
नियमित पुराय कोशिका संरचना आनी विश्लेशण. रेकॉर्ड करचे पयलीं रोखडेंच पिपेटांत सकयल दिल्ले पदार्थ आशिल्ले भितरले विरय भरचे: ४.० मिमी.केसीएल, २.० मिमी.NaCl, ०.२ मिमी.ईजीटीए, १३५.० मिमी.पोटॅशियम ग्लुकोनेट, १०.० मिमी १०.० मिमी.क्रिएटिनिन फॉस्फेट पीएच ७.२५ मेरेन समायोजीत केलें आनी आसमाटिक दाब २९० मिमी.(सुक्रोज) आशिल्लो. पड्डो फुटपाखातीर ० पीए हें बळ दिल्या उपरांत रोखडेंच विश्रांती घेतिल्ल्या पड्ड्याची विभव मेजली. -40, -30, -20, आनी -10 pA च्या अतिध्रुवीय प्रवाहांक लागून इनपुट प्रतिकार मेजतात. विद्युत्दाब प्रतिसादाचें प्रमाण मेजचें आनी ओमच्या नेमाचो उपेग करून इनपुट प्रतिरोध मेजचो. 5 मिनटां खातीर विद्युत्दाब क्लॅम्पांत आपशींच जावपी क्रियाशीलता नोंद केली आनी अर्द स्वयंचलीत वळख लिपीचो उपेग करून इगोर प्रो (आवृत्ती 32 7.01, वेवमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगन, अमेरिकेचीं संयुक्त संस्थानां) हातूंत sPSC वळखून मेजली. बॅटरी वेगवेगळ्या विभवांचेर (-110 mV पासून सुरू) क्लॅम्प करून आनी 5 mV पांवड्यानी विद्युत्दाब वाडोवन IV वक्र आनी स्थिर अवस्थेचो प्रवाह मेजतात. विध्रुवीय प्रवाह घालून एपीच्या उत्पादनाची चांचणी केल्ली. विध्रुवीय प्रवाह नाडी लागू करतना -70 mV चेर कोशिका क्लॅम्प करात. दर एका रेकॉर्डिंग युनिटाचो स्टेप आकार वेगवेगळो समायोजीत करचो (10 ते 60 pA). सगळ्यांत चड एपी कंप्रता निर्माण करपी नाडी स्पायक हाताळणी करून चडांत चड एपी कंप्रता मेजची. पयली एक वा चड एपी सुरू करपी विध्रुवीय नाडीचो दुसरो व्युत्पत्ती वापरून एपी थराचे विश्लेशण करतात.
छिद्रीत पॅच संरचना आनी विश्लेशण. मानक प्रोटोकॉल वापरून छिद्रीत पॅच रेकॉर्डिंग करप. एटीपी आनी जीटीपी मुक्त पिपेट वापरात, जातूंत फुडले घटक नासतात: १२८ मिमी.ग्लुकोनेट के, १० मिमी.केसीएल, १० मिमी.हेपेस, ०.१ मिमी.ईजीटीए आनी २ मिमी.एमजीसीएल२ आनी पीएच ७.२ (केओएच वापरून) समायोजीत करात. कोशिका पड्ड्याची अनियंत्रीत पारगम्यताय आडावपाखातीर कोशिकेभितरल्या विरयांतल्यान एटीपी आनी जीटीपी वगळटात. पॅच पिपेटांत अँम्फोटेरिसीन आशिल्लें अंतर्गत विरय (सुमार २०० ते २५०μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) भरून पंच केल्लो पॅच रेकॉर्ड मेळटा. अँम्फोटेरिसीन डायमिथिल सल्फोक्सायडांत (निमाणी सांद्रताय: ०.१ ते ०.३%; डीएमएसओ; डी८४१८, सिग्मा-आल्ड्रिच) विरगळायलें. वापरिल्ल्या डीएमएसओच्या सांद्रतायेचो अभ्यास केल्ल्या तंत्रिका कोशिकांचेर व्हडलोसो परिणाम जालो ना. मुठ मारपाचे प्रक्रियेंत चॅनल प्रतिकार (Ra) हाचेर सतत नदर दवरताले आनी Ra आनी AP हांचें विस्तार स्थीर जाले उपरांत (20-40 मिनटां) प्रयोग सुरू केलो. स्वतःस्फूर्त क्रियाशीलता विद्युत्दाब आनी/वा प्रवाह क्लॅम्पांत २ ते ५ मिनटां मेजतात. इगोर प्रो (आवृत्ती 7.05.2, वेवमेट्रिक्स, अमेरिकेचीं संयुक्त संस्थानां), एक्सेल (आवृत्ती 2010, मायक्रोसॉफ्ट कॉर्पोरेशन, रेडमंड, अमेरिकेचीं संयुक्त संस्थानां) आनी ग्राफपॅड प्रिज्म (आवृत्ती 8.1.2, ग्राफपॅड सॉफ्टवेअर इंक., ला जोला, सीए) वापरून डेटा विश्लेशण केलें. अमेरिकेचीं संयुक्त संस्थानां). सहज एपी वळखुपा खातीर, IgorPro चें NeuroMatic v3.0c प्लग-इन वापरतात. दिल्ले कूंड वापरून एपी आपोआप वळखुप, जी दर एका रेकॉर्ड खातीर वैयक्तीक रितीन समायोजीत केल्ली आसता. स्पायक अंतर वापरून चडांत चड क्षणीक स्पायक कंप्रता आनी सरासरी स्पायक कंप्रता आशिल्ली स्पायक कंप्रता थारावची.
पीएन एकांतवास. आदीं उजवाडाक आयिल्ल्या प्रोटोकॉलाक अनुकूल जावन मुयाच्या मस्तिष्ककोशांतल्यान विशिश्ट पांवड्यार पीएन शुध्द केल्ले (58). थोडयाच उतरांनी सांगपाचें जाल्यार मस्तिष्ककोशाचें विच्छेदन करून बर्फाच्या थंड विच्छेदन माध्यमांत [HBSS Ca2+ आनी Mg2+ नासतना, 20 mM ग्लुकोज, पेनिसिलीन (50 U/ml) आनी स्ट्रेप्टोमायसीन (0.05 mg/ ml) हांणी पूरक केल्लें] किसले आनी उपरांत माध्यम पपईनांत [HBSS, 1-cysteine·HCl हांणी पूरक केल्लें (१ मिग्रॅ / मिलिलीटर), पपेन (१६ यू / मिलिलीटर) आनी डिऑक्सीरायबोन्युक्लियस I (डीएनएज I; ०.१ मिग्रॅ/मिली)] ३० सॅ. पयलीं तांतयांचो श्लेष्म (१० मिग्रॅ/मिली), बीएसए (१० मिग्रॅ/मिली) आनी डीएनएज (०.१ मिग्रॅ/मिली) आशिल्ल्या एचबीएसएस माध्यमांत एन्झायमीक पचन जावचें न्हय म्हूण कोठारांतल्या तापमानांत आनी उपरांत २० मिमी डीएनएज (०.१ मिग्रॅ/मिली) एकेच पेशी सोडटात. हातूंतल्यान मेळिल्लें पेशी निलंबन ७०μm कोशिका गाळणींतल्यान गाळून उपरांत पेशी अपक्षेपण (१११० आरपीएम, ५ मिनटां, ४ सॅ.) करून गुळयो करून क्रमवारी माध्यमांत [HBSS, २० मिमी (०.०५ मिग्रॅ/मिली)]; प्रोपिडियम आयोडायडान कोशिकांच्या जिवीतक्षमतायचें मुल्यांकन करतात आनी कोशिकांची घनताय १×१०६ ते २×१०६ कोशिका/मिली मेरेन समायोजीत करतात. प्रवाह कोशिकामिती पयलीं ५० मायक्रोन कोशिका गाळणींतल्यान निलंबन गाळटाले.
प्रवाह कोशिकामापक. FACSAria III मशीन (BD Biosciences) आनी FACSDiva सॉफ्टवेअर (BD Biosciences, version 8.0.1) वापरून 4 सॅ. कोशिका निलंबनाची क्रमवारी 100 μm नोजल वापरून 20 psi दाबाखाला ~2800 घडणुको/सेकंद दरान केल्ली. पारंपारीक गेटींग निकश (कोशिक आकार, द्विधा भेद आनी प्रकीर्णन खाशेलपणां) हेर कोशिका प्रकारांतल्यान पीएनचें योग्य वेगळेपण सुनिश्चीत करूंक शकना देखून गेटींग रणनिती मायटोवायएफपी+ आनी नियंत्रण मायटोवायएफपी − मुयांमदल्या वायएफपी तीव्रता आनी ऑटोफ्लोरोसेन्स हांची थेट तुळा करपाचेर आदारीत थारायतात. नमुन्याचेर ४८८ एनएम लेसर रेशेन किरणोत्सर्ग करून वायएफपी उत्तेजीत करतात आनी ५३०/३० एनएम बँड पास फिल्टर वापरून संकेत सोदून काडटात. मायटोवायएफपी+ मुयांमदीं रोसा२६-मायटोवायएफपी रिपोर्टर जनुकाच्या सापेक्ष बळग्याचोय उपेग तंत्रिका कोशिकांच्या कुडीच्या आनी अक्षतंतूच्या कुडक्यांचो भेद करपाखातीर करतात. ७-एएडी ५६१ एनएम हळडुव्या लेसरान उत्तेजीत करतात आनी ६७५/२० एनएम बँडपास फिल्टरान सोदून काडून मेल्लीं पेशी वगळटात. एकाच वेळार एस्ट्रोसायटी वेगवेगळे करपाखातीर कोशिका निलंबनाचेर एसीएसए-२-एपीसी हांणी रंगयले, उपरांत नमुन्याचेर ६४० एनएम लेसर रेशेन किरणोत्सर्ग केलो आनी ६६०/२० एनएम बँडपास फिल्टर वापरून संकेत सोदून काडलो.
एकठांय केल्ल्या पेशींचें अपक्षेपण (१११० आरपीएम, ५ मिनटां, ४ सॅ.) करून गुळयो घालून वापरमेरेन -८० सॅ. Mfn2cKO मुयो आनी तांच्या कोयराच्या पिलांचें वर्गीकरण एकाच दिसा करतात, जाका लागून प्रक्रियात्मक बदल उणो जाता. FACS डेटा सादरीकरण आनी विश्लेशण FlowJo सॉफ्टवेअर (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) वापरून केलें.
वयर सांगिल्लेप्रमाण (59) उपरांतच्या mtDNA प्रमाणीकरणाखातीर क्रमवारीत केल्ल्या तंत्रिका कोशिकांतल्यान डीएनए वेगळें करपाखातीर रियल-टायम पीसीआर वापरतात. सुरवेक वेगवेगळ्या संख्येच्या पेशींचेर qPCR चालीक लावून रेखीवता आनी कूंड संवेदनशीलताय चांचणी केल्ली. थोडयाच उतरांनी ५० मिमी.ट्रायस-एचसीएल (पीएच ८.५), १ मिमी.ईडीटीए, ०.५% ट्वीन २० आनी प्रथिनॅज के (२०० एनजी/मिली) आशिल्ल्या लायसिस बफरांत ३०० पीएन एकठांय करून ५५ सॅ.तापमानाचेर १२० मिनटां उबयतात. फुडें ९५ सॅ.तापमानाचेर १० मिनटां पेशी उब्यो दवरून प्रथिनॅज के पुरायपणान निश्क्रीय जाली.mt-Nd1 खातीर विशिश्ट आशिल्ल्या TaqMan संशोधन (Thermo Fisher) वापरून 7900HT Real-Time PCR पद्दतींत (Thermo Fisher Scientific) अर्द परिमाणात्मक पीसीआर पद्दतीन mtDNA मेजलें. सायन्स, कॅटलॉग क्रमांक Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर सायन्टिफिक, कॅटलॉग क्रमांक AIVI3E8) आनी 18S (थर्मो फिशर सायन्टिफिक, कॅटलॉग क्रमांक Hs99999901_s1) जीन.
प्रोटीओम नमुनो तयार करप. ९५ सॅ.तापमानाचेर १० मिनटां तापयून आनी सोनिकेशन करून, लायसिस बफरांत [६ एम ग्वानिडीन क्लोरायड, १० मिमी.ट्रायस(२-कार्बोक्झीइथिल) फॉस्फीन हायड्रोक्लोरायड, १० मिमी. बायोरप्टर (डायजेनोड) 10 मिनटां (30 सेकंद नाडी / 30 सेकंद विराम काळ) चालू. नमुनो २० मिमी.ट्रायस-एचसीएल (पीएच ८.०) हातूंत १:१० पातळ करून ३०० एनजी ट्रिप्सिन भांगर (प्रोमेगा) हातूंत भरसून ३७ सॅ. दुसर् या दिसा नमुनो २०,००० ग्रॅ.चेर २० मिनटां केंद्रोत्सारीत केलो. सुपरनॅटॅंट ०.१% फॉर्मिक आम्लान पातळ करून स्वता तयार केल्ल्या स्टेजटिप्सान विरयाचें मीठ काडून उडयलें. नमुनो स्पीडव्हॅक यंत्रांत (एपेनडॉर्फ कंसेन्ट्रेटर प्लस ५३०५) ४५ सॅ.तापमानाचेर सुकयलो आनी उपरांत पॅप्टायड ०.१% फॉर्मिक आम्लांत स्थलांतरीत केलो. सगळे नमुने एकाच वेळार एकाच मनशान तयार केल्ले. एस्ट्रोसायटीच्या नमुन्यांचे विश्लेशण करपाखातीर ४ μg मीठ नाशिल्ल्या पॅप्टायडांचेर टॅंडम मास टॅग (TMT10plex, catalog number 90110, Thermo Fisher Scientific) वापरून पॅप्टायड आनी TMT अभिक्रियाकारक प्रमाण 1:20 अशें लेबल लायलें. टीएमटी लेबलिंग करपाखातीर ०.८ मिग्रॅ टीएमटी अभिक्रियाकारक ७० μl निर्जल एसीएनांत परतून स्थलांतरीत करून सुकयल्ल्या पॅप्टायडाची पुनर्रचना ९ μl ०.१ एम टीईएबी (ट्रायएथिलअमोनियम बायकार्बोनेट) हातूंत करून तातूंत एसीएनांत ७ μl टीएमटी अभिक्रियाकारक घालून तातूंत ०.१ एम.टी.ई.ए.बी. ताची सांद्रताय ४३.७५% आशिल्ली. ६० मिनटां उब्या दवरल्या उपरांत २ μl ५% हायड्रोक्सिलामायनान विक्रिया शांत केली. लेबल आशिल्ले पॅप्टायड एकठांय करून सुकयले, 0.1% फॉर्मिक आम्ल (FA) हातूंत 200μl परतून स्थलांतरीत करून दोन भाग करून उपरांत स्वता तयार केल्ले स्टेजटिप्स वापरून मीठ काडून उडयले. अल्टीमेट ३००० अति उच्च कार्यक्षमताय द्रव वर्णपटलेखन (अल्टीमेट ३००० अति उच्च कार्यक्षमताय द्रव वर्णपटलेखन) वापरून दोन अर्दांतल्या एका अर्दाचें १३०Å१.७μm C१८ कणांनी भरिल्ल्या १ मिमी.x १५० मिमी. थर्मो फिशर सायन्टिफिक). ३०μl/मिनिटाच्या प्रवाह दरान पॅप्टायड वेगळे करून ९६ मिनटां टप्प्या टप्प्यान ग्रेडियेंट करून १% ते ५०% बफर बी ८५ मिनटां, ३ मिनटां ५०% ते ९५% बफर बी, उपरांत ९५ % बफर बी ८ मिनटां वेगळीं करचीं; बफर अ हें ५% एसीएन आनी १० मिमी.अमोनियम बायकार्बोनेट (एबीसी) आनी बफर ब हें ८०% एसीएन आनी १० मिमी.एबीसी आसता. दर ३ मिनटांनी अपूर्णांक एकठांय करून तांकां दोन गट (१ + १७, २ + १८ आदी) करून निर्वात अपक्षेपकांत सुकयतात.
एलसी-एमएस/एमएस विश्लेशण. द्रव्यमान वर्णपटमापन करपाखातीर पॅप्टायड (क्रमांक r119.aq) 25 सेंमी., 75 मायक्रोन भितरल्या व्यासाच्या पिकोफ्रिट विश्लेशणात्मक स्तंभाचेर (नवो उद्देश भिंग, भाग क्रमांक PF7508250) 1.9 मायक्रोन रिप्रोसिल-पुर 120 सी18-एक्यू माध्यम (Dr. Maisch, mat) वापरून सज्ज केल्ले, EASY-nLC वापरून वेगळे केल्ले १२०० (थर्मो फिशर सायन्टिफिक, जर्मनी). स्तंभ ५० सॅ. बफर अ आनी ब हीं अनुक्रमान उदकांत ०.१% फॉर्मिक आम्ल आनी ८०% एसीएनांत ०.१% फॉर्मिक आम्ल आसतात. ६% ते ३१% बफर बी ६५ मिनटां आनी ३१% ते ५०% बफर बी ५ मिनटां २०० एनएल/मिनिटाच्या ग्रेडियेंटान पॅप्टायड वेगळे केल्ले. विरगळिल्ल्या पॅप्टायडांचें ऑर्बिट्राप फ्युजन द्रव्यमान वर्णपटमापक (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) ह्या यंत्राचेर विश्लेशण केलें. पॅप्टायड पूर्ववर्ती m/z माप 350 ते 1500 m/z ह्या आवांठात 120,000 रिझोल्यूशनान करतात. २७% सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा वापरून उच्च ऊर्जा सी ट्रॅप डिसोसिएशन (HCD) विच्छेदनाखातीर २ ते ६ अशी आघात अवस्था आशिल्लो सगळ्यांत बळिश्ट पूर्ववर्ती वेंचून काडटात. चक्राचो वेळ 1 s असो थारायला. ५×१०४ हें सगळ्यांत ल्हान एजीसी लक्ष्य आनी चडांत चड ८६ एमएस इंजेक्शन वेळ वापरून आयन सापळ्यांत पॅप्टायड कुडकेचें m/z मोल मेजलें. विखंडन जाले उपरांत पूर्ववर्ती पदार्थाक 45 सेकंद गतिशील वगडावपाचे वळेरेंत दवरलो. टीएमटी लेबल आशिल्ले पॅप्टायड ५० सेंमी., ७५ मायक्रोन अॅक्लेम पेपमॅप स्तंभाचेर (थर्मो फिशर सायन्टिफिक, कॅटलॉग क्रमांक १६४९४२) वेगळे केल्ले आनी उच्च क्षेत्र असममित तरंगरूप आयन (एफएआयएमएस) उपकरणांनी सज्ज आशिल्ल्या ऑर्बिट्राप लुमोस ट्रायब्रिड द्रव्यमान वर्णपटमापक (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) हाचेर स्थलांतर वर्णपटांचें विश्लेशण केलें (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) −50 आनी −70 व्ही ह्या दोन भरपाय विद्युत्दाबांचेर काम करता.समक्रमण पूर्ववर्तीचेर आदारीत वेंचून काडिल्लो एमएस3 टीएमटी अहवाल आयन संकेत मापनाखातीर वापरतात. पॅप्टायड वेगळेपण EASY-nLC 1200 हाचेर ९०% रेखीव ग्रेडियेंट इल्युशन वापरून ६% ते ३१% बफर सांद्रतायेन केलें; बफर अ हें ०.१% एफए, आनी बफर ब ०.१% एफए आनी ८०% एसीएन आशिल्लें. विश्लेशणात्मक स्तंभ ५० सॅ. FAIMS भरपाय विद्युत्दाबा प्रमाण मूळ फायल विभागपाक FreeStyle (आवृत्ती 1.6, Thermo Fisher Scientific) वापरात.
प्रथिनांची वळख आनी प्रमाणीकरण. एकत्रीत अँड्रोमेडा सोद इंजिन वापरून, मॅक्सक्वांट आवृत्ती 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) वापरून मूळ डेटाचें विश्लेशण केलें. Aequorea victoria कडल्यान मेळिल्ल्या Cre recombinase आनी YFP क्रमांकां भायर, मुयाच्या संदर्भ प्रोटीओमाचो (Proteome ID UP000000589, मे 2017 वर्सा UniProt कडल्यान डावनलोड केल्लो) पॅप्टायड तुटके वर्णपटांत सोद लायलो. मेथिओनायन ऑक्सिडीभवन आनी प्रथिन एन-टर्मिनल एसिटाइलेशन हें परिवर्तनशील बदल म्हणून थारायलें; सिस्टीन कार्बामोयल मिथिलेशन हें स्थिर बदल म्हणून थारायलें. पचन मापदंड “विशिश्टताय” आनी “ट्रिप्सिन/पी” अशें सेट केल्ले आसात. प्रथिन वळखुपाखातीर वापरिल्ल्या पॅप्टायड आनी रेझर पॅप्टायडांची उण्यांत उणी संख्या १; खाशेल्या पॅप्टायडांची उण्यांत उणी संख्या ०.पॅप्टायड नकाश जुळोवपाचे परिस्थितींत प्रथिन वळखपाचें प्रमाण ०.०१ आशिल्लें. “दुसरो पॅप्टायड” पर्याय सक्षम केला. वेगवेगळ्या मूळ फायलीं मदीं यशस्वी वळख हस्तांतरीत करपाक “match between runs” पर्याय वापरात. लेबल मुक्त प्रमाणीकरण (LFQ) खातीर LFQ उण्यांत उणें प्रमाण गणना 1 वापरात (60). दर एका वेळार उण्यांत उण्या एका जीनोटायप गटांतल्या उण्यांत उण्या दोन वैध मोलाखातीर एलएफक्यू तीव्रता गाळटात आनी रुंदायेच्या सामान्य वितरणांतल्यान बाह्यरुपण करतात. ०.३ आनी सकयल १.८. LFQ परिणामांचें विश्लेशण करपाक Perseus संगणन प्लॅटफॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) आनी R (https://r-project.org/) वापरात. लिमा सॉफ्टवेअर पॅकेजींतल्यान द्विपक्षीय मध्यम टी चांचणी विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेशणाखातीर वापरली (61). ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally आनी pheatmap हांचो उपेग करून संशोधनात्मक डेटा विश्लेशण करतात. टीएमटी आदारीत प्रोटीओमिक्स डेटाचें विश्लेशण मॅक्सक्वांट आवृत्ती 1.6.10.43 वापरून केलें. सप्टेंबर 2018 त डाउनलोड केल्ल्या UniProt च्या मनीस प्रोटीओमिक्स डेटाबेसा वयल्यान कच्चो प्रोटीओमिक्स डेटा सोदचो.विश्लेशणांत निर्मात्यान दिल्ल्या समस्थानिक शुध्दताय दुरुस्ती घटकाचो आस्पाव आसा. विभेदक अभिव्यक्ती विश्लेशणाखातीर R मदलो लिमा वापरचो. मूळ डेटा, डेटाबेस सोद परिणाम, आनी डेटा विश्लेशण कार्यप्रवाह आनी परिणाम सगळे डेटा संच वळखपी PXD019690 कडेन PRIDE भागीदार रिपॉझिटरी वरवीं ProteomeXchange युतींत सांठयतात.
कार्यात्मक टिपणी विश्लेशणाक समृध्द करतात. 8 सप्तकांत डेटा संचांतल्या कार्यात्मक टिपणी संज्ञांची गिरेस्तकाय थारावपाखातीर Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) साधनाचो उपेग केलो (आकृती 1). थोडयाच उतरांनी एलसी-एमएस/एमएस (टॅंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेशणापसून मेळिल्ली परिमाणात्मक प्रथिन वळेरी फुडल्या फिल्टर निकशावांगडा वापरतात: मस मस्क्युलस ही जाती आनी फाटभूंय म्हणून वेंचून काडटात आनी वर्गांत बेंजामिनीन ०.०५ वा ताचेपरस उण्या समृध्दीखातीर समायोजीत केल्लें पी मोल म्हत्वाचें मानतात. ह्या आलेखाखातीर समायोजीत पी मोलाचेर आदारीत दर एका क्लस्टरांतले पयले पांच अतिरिक्त वर्ग दाखयल्यात. बेंजामिनी, क्रिएगर आनी येकुटेली हांच्या दोन टप्प्यांच्या रेखीव बुस्ट प्रोग्राम (Q = 5%) वापरून मल्टीपल टी-परीक्षा वापरून दर एका वर्गांत वळखून घेतिल्ल्या म्हत्वाच्या उमेदवारांचेर वेळ-कोर्स प्रथिन अभिव्यक्तीचें विश्लेशण करतात आनी दरेक वळीचें वेगवेगळे विश्लेशण करतात. एकसारको एसडी आपणावपाची गरज ना.
ह्या अभ्यासाच्या परिणामांची प्रकाशीत डेटाबेसांकडेन तुळा करपाखातीर आनी आकृती 1 त व्हेन आकृती तयार करपाखातीर आमी परिमाणात्मक प्रथिन वळेरी मायटोकार्टा 2.0 टिपणींवांगडा जोडली (24). आकृती तयार करपाक ऑनलायन साधन Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) वापरात.
प्रोटीओमिक्स विश्लेशणाखातीर वापरिल्ल्या सांख्यिकी प्रक्रियांविशीं सविस्तर म्हायतीखातीर उपकार करून साहित्य आनी पद्दती ह्या संबंदीत विभागाचो संदर्भ घेयात. हेर सगळ्या प्रयोगांखातीर ताचेकडेन संबंदीत आख्यायिकेंत सविस्तर म्हायती मेळटा. हेर तरेन सांगले बगर सगळो डेटा सरासरी ± SEM असो दर्शयला आनी सगळे सांख्यिकी विश्लेशण ग्राफपॅड प्रिज्म 8.1.2 सॉफ्टवेअर वापरून केल्ले.
ह्या लेखा खातीर पूरक साहित्या खातीर, उपकार करून पळयात http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
हो क्रिएटिव्ह कॉमन्स एट्रिब्यूशन-बिगर वेपारी परवान्याच्या नेमा खाला वितरीत केल्लो मुक्त प्रवेश लेख आसा, जो खंयच्याय माध्यमांत वापर, वितरण आनी पुनरुत्पादन करपाक परवानगी दिता, जो मेरेन निमाणो वापर वेवसायीक फायद्या खातीर ना आनी मूळ काम बरोबर आसा असो आदार आसा. संदर्भ.
टिप: आमी तुमकां फकत तुमचो ईमेल पत्तो दिवपाक सांगतात, जाका लागून तुमी पानाचेर शिफारस करतात त्या मनशाक तुमकां ईमेल पळोवंक जाय आनी तो स्पॅम न्हय हें कळटलें. आमी खंयचेच ईमेल पत्ते कॅप्चर करचे नात.
तुमी भेटीदार आसात काय ना हाची चांचणी करपाक आनी आपोआप स्पॅम सादर करपाक आडावपाक हो प्रस्न वापरतात.
ई.मोटोरी, आय.अतानासोव, एस.एम.व्ही.कोचन, के.फोल्झ-डोनाहुए, व्ही.साक्थिवेलू, पी.जियावालिस्को, एन.टोनी, जे.पुयाल, एन.-जी. लार्सन हांणी केला
अकार्यक्षम तंत्रिका कोशिकांच्या प्रोटीओमिक्स विश्लेशणावरवीं तंत्रिका तंत्राच्या क्षयरोगाक आळाबंदा हाडपाखातीर चयापचयाचे कार्यक्रम सक्रिय जातात अशें दिसून आयलें.
ई.मोटोरी, आय.अतानासोव, एस.एम.व्ही.कोचन, के.फोल्झ-डोनाहुए, व्ही.साक्थिवेलू, पी.जियावालिस्को, एन.टोनी, जे.पुयाल, एन.-जी. लार्सन हांणी केला
अकार्यक्षम तंत्रिका कोशिकांच्या प्रोटीओमिक्स विश्लेशणावरवीं तंत्रिका तंत्राच्या क्षयरोगाक आळाबंदा हाडपाखातीर चयापचयाचे कार्यक्रम सक्रिय जातात अशें दिसून आयलें.
©2020 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द अॅडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सगळे हक्क राखीव आसात. एएएएस हिनारी, अगोरा, ओआरे, कोरस, क्लॉकएसएस, क्रॉसरेफ आनी काउंटर हांचो भागीदार आसा. सायन्सएडव्हान्सेस आयएसएन 2375-2548.