कोशिका विभागणी आनी होमियोस्टॅसिस सांबाळपाखातीर स्राव मार्गांतल्या प्रथिनांची क्रमवारी करप गरजेचें आसता. कवच-मध्यस्थींतल्यान क्रमवारी करपावांगडाच स्रावी येरादारीचे प्रक्रियेंत किनेसिन क्रमवारींत लिपिडांची भुमिका हो बऱ्याच काळासावन चलत आयिल्लो मुळावो प्रस्न आसून ताका अजून जाप मेळूंक ना. हांगा, आमी 3D एकाच वेळार बहुरंगी उच्च रिझोल्यूशन रियल-टायम प्रतिमा तयार करून नव्यान संश्लेशित केल्लीं ग्लायकोसायलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-स्थिर प्रथिनां खूब लांब सेरामायड लिपिड भाग आशिल्लीं प्रथिनां एकठांय करून तांकां खाशेल्या अंतःप्लाझ्मांत वर्गीकरण करतात नेट भायर सरपाची सुवात, जी पड्ड्याभायर प्रथिनांनी वापरिल्ल्या प्रथिनापरस वेगळी आसा हें सिध्द करपाखातीर विव्होंत सिध्द करतात. तेभायर आमी दाखयतात की अंतःप्लाझ्मीक जाळी पड्ड्यांतल्या सेरामायडाची साखळी लांबाय हे क्रमवारी वेंचणुकेखातीर म्हत्वाची आसा. आमच्या अभ्यासावरवीं लिपिड साखळी लांबायचेर आदारीत प्रथिन मालाचे स्रावी मार्गांतल्या निवडक निर्यात सुवातींनी वर्गीकरण करपाखातीर पयलो प्रत्यक्ष इन विव्हो पुरावो मेळटा.
उपरांत युकेरियोटीक पेशींत अंतःप्लाझ्मीक जाळींत (ER) संश्लेशित केल्ल्या प्रथिनांची येरादारी करतना स्राव मार्गांतल्यान क्रमवारी करून तांच्या फावो त्या कोशिकीय गंतव्याक पावयतात (1). कोट-मध्यस्थींतल्यान क्रमवारी करपावांगडाच कांय लिपिड विशिश्ट प्रथिनांपरस विशिश्ट पड्ड्याच्या डोमेनांत एकठांय करून निवडक भायर सरपाचे बिंदू म्हणूनय काम करूं येतात असो बरोच अदमास आशिल्लो (2-5). पूण ही संभाव्य लिपिड आदारीत यंत्रणा सिध्द करपाखातीर अजूनय प्रत्यक्ष इन विव्हो पुराव्यांचो उणाव आसा. ही मुळावी समस्या सोडोवपाखातीर आमी यीस्टांत ग्लायकोसायलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (GPI) एंकर प्रथिनां (GPI-APs) ईआरांतल्यान वेगवेगळ्या तरेन निर्यात कशी जाता हाचो अभ्यास केलो. जीपीआय-एपी हीं लिपिडाक जोडिल्लीं कोशिका पृश्ठभागाचीं वेगवेगळीं प्रथिनां आसात ( 6, 7). जीपीआय-एपी हें स्रावीत प्रथिन आसून तें प्लाझ्मा पड्ड्याच्या भायल्या पानांक ग्लायकोलिपिड भागांतल्यान (जीपीआय एंकर) जोडिल्लें आसता. जीपीआय एंकरांक ईआर लुमेनांतले पुरातनवादी अणकार उपरांतचे बदल म्हणून ते मान्य करतात (8). जोडल्या उपरांत जीपीआय-एपी गोल्गी यंत्रांतल्यान (5, 9) ईआरांतल्यान प्लाझ्मा पड्ड्यामेरेन वता. जीपीआय एंकर आशिल्ल्यान जीपीआय-एपीची येरादारी पड्ड्याभायर स्रावीत प्रथिनांपसून (हेर प्लाझ्मा पड्ड्याच्या प्रथिनां सयत) स्राव मार्गांतल्यान वेगळी व्हरता (5, 9, 10). यीस्ट पेशींत जीपीआय-एपी अंतःप्लाझ्मीक जाळींतल्या हेर स्रावीत प्रथिनांपसून वेगळे करतात आनी उपरांत कोट प्रथिन संकुल II (COPII) हांणी गुठलायल्ल्या खाशेल्या पुटिकांनी पॅकेज करतात (6, 7). ईआर निर्यात प्रक्रियेंतल्या हे वर्गीकरण प्रक्रियेचे निर्धारक स्पश्ट नात, पूण हे यंत्रणेखातीर लिपिडांची गरज आसूं येता, खास करून जीपीआय एंकराच्या लिपिड भागाचें संरचनात्मक पुनर्रचणूक करपाची गरज आसूं येता असो अदमास आसा (5, 8). यीस्टांत जीपीआय जोडल्या उपरांत रोखडेंच जीपीआय लिपिड रिमॉडेलिंग सुरू जाता आनी जायत्या प्रकरणांनी ताका लागून सेरामायड २६ कार्बन लांब साखळी संतृप्त फॅटी अॅसिडाकडेन (C26:0) बंधन जाता (11, 12). आतां मेरेन यीस्ट पेशींनी तयार केल्लो मुखेल सेरामायड म्हळ्यार सी२६ सेरामायड. ईआरांत ताचें संश्लेशण जाता आनी तातूंतलें चडशें सीओपीआयआय पुटिका वरवीं गोल्गी यंत्रांत निर्यात जाता (13). जीपीआय-एपीच्या ईआर निर्यातांत खासा करून चालू आशिल्ल्या सेरामायड संश्लेशणाची गरज आसता (14, 15), आनी बदलाक गोल्गी यंत्रांतल्या सेरामायडाचें इनोसिटोल फॉस्फेट सेरामायड (IPC) हें रुपांतर जीपीआय एंकर संश्लेशणाचेर आदारून आसता (16). कृत्रीम पड्ड्यांवांगडा केल्ल्या जैव भौतिक अभ्यासांतल्यान खूब लांब ऍसिल साखळी आशिल्ले सेरामायड एकठांय येवन खाशेले भौतिक गुणधर्म आशिल्ले क्रमबद्ध डोमेन तयार जावंक शकतात अशें दिसून आयलां (17, 18). ह्या आकडेवारींतल्यान C26 सेरामायड आनी C26 सेरामायडावांगडा GPI-AP हीं तांच्या भौतिक गुणधर्मांचो उपेग करून तुळेन गडबड आशिल्ल्या ईआर पड्ड्याच्या लिपिड वातावरणांतल्या वेवस्थीत प्रदेशांत वा प्रदेशांत एकठांय येतात अशी कल्पना येता. तातूंत मुखेलपणान ल्हान आनी असंतृप्त ग्लिसरॉललिपिड (C16:1 आनी C18:1) (19, 20) हांचो आस्पाव जाता. हे प्रदेश विशिश्ट ईआर भायर सरपाच्या सुवातींनी (ERES) निवडून लक्ष केंद्रीत करतले, जंय सेरामायड आनी सेरामायड आदारीत जीपीआय-एपी हांकां त्याच समर्पीत COPII पुटिका (5) गोल्गीक सह-वाहन करूं येता.
ह्या अभ्यासांत आमी सुपर-रिझोल्यूशन कॉनफोकल रियल-टायम इमेजिंग मायक्रोस्कोपी (SCLIM) वापरून हे लिपिड आदारीत यंत्रणेची थेट चांचणी केल्या, जी एक अत्याधुनीक मायक्रोस्कोपी तंत्र आसा, जी एकाच वेळार प्रतिदीप्त लेबल आशिल्ल्या प्रथिनांचें निरिक्षण करूंक शकता तीन रंग आनी तीन आयामी (3D) प्रतिमा जिव्या पेशींत अत्यंत चड रिझोल्यूशन आनी गती आसता (21, 22).
एस. ईआरचें वर्गीकरण तपासपाखातीर आमी एक आनुवंशिक पद्दत वापरली जी नव्यान संश्लेशित केल्ल्या मालाची ईआरईएसांत भितर सरपी विव्होंत थेट दृश्टीकोन करपाक शकता (7, 23). माल म्हूण आमी पाचव्या प्रतिदीप्त प्रथिनान (GFP) लेबल केल्लें C26 सेरामायड आदारीत GPI-AP Gas1 आनी नियर-इन्फ्रारेड फ्लुओरेसेंट प्रथिन (iRFP) हांणी लेबल केल्लें ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावीत प्रथिन Mid2 निवडलें, हीं दोनूय प्लाझ्मा पड्ड्याक लक्ष्य करतात (24-26). sec31-1 तापमान संवेदनशील उत्परिवर्तनशील प्राण्यांत हे दोन माल गॅलॅक्टोज प्रेरक प्रवर्तक आनी घटक ERES निशाणाखाला अभिव्यक्त जातात. अत्यंत तापमानांत (37° से.) sec31-1 उत्परिवर्तनाचो COPII कोट घटक Sec31 च्या कार्याचेर परिणाम जावन COPII अंकुरण आनी ईआर निर्यात आडावपाखातीर नव्यान संश्लेशित केल्लो माल ईआर (23) हांगा जमता. उण्या तापमानांत (२४ सॅ.) थंड केल्या उपरांत sec31-1 उत्परिवर्तित पेशी स्राव क्षेत्रांतल्यान परतून मेळ्ळ्यो आनी एकठांय जाल्लो नवो कृत्रीम माल ईआरांतल्यान निर्यात करपाक लागलो. सीएलआयएम व्हिज्युअलायझेशनांतल्यान नव्यान संश्लेशित केल्ले चडशे Gas1-GFP आनी Mid2-iRFP 37 सॅ. Mid2-iRFP पुराय ईआर पड्ड्याचेर वितरीत आशिल्ल्यान आनी Gas1-GFP विच्छेदीत ईआर पड्ड्याच्या वाठारांत सांद्रीत जावन एकठांय जाल्ल्यान तांचें वितरण पुरायपणान वेगळें आसता (आकृती 1, अ ते क आनी सिनेमा एस1). तेभायर आकृती 1D त दाखयल्ले प्रमाण Gas1-GFP क्लस्टरांत Mid2-iRFP ना. ह्या निकालांक लागून जीपीआय-एपी आनी ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनां सुरवेक वेगवेगळ्या ईआर पड्ड्याच्या प्रदेशांत वेगळीं जाल्लीं अशें दिसून येता. Gas1-GFP चोमो mCherry च्या COPII कोट प्रथिन Sec13 (आकृती 1, E आनी F, आनी S1 सिनेमा) (23) हें लेबल आशिल्ल्या विशिश्ट ERES कडेन लागीं आसता.
sec31-1 पेशी गॅलॅक्टोज-प्रेरित स्राव, लांब ऍसिल साखळी (C26) सेरामायड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, पाचवी) आनी ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिन Mid2-iRFP (TMP, निळें) अभिव्यक्त करतात आनी हें Constructive ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37° से २४ सॅ., आनी ५ मिनटां उपरांत एससीएलआयएम कडल्यान प्रतिमा तयार केल्ली. (A ते C) हातूंत विमानाची प्रतिनिधीक विलीन केल्ली वा एकूच 2D प्रतिमा (A), 10 z-विभागांची 2D प्रक्षेपण प्रतिमा (B) वा मालाची 3D कोशिक गोलार्ध प्रतिमा आनी ERES मार्करांची (C) दाखयल्या. स्केल बार 1μm (अ आनी ब). प्रमाण एकक ०.५५१μm (C) आसता. Gas1-GFP हें स्वतंत्र ईआर प्रदेशांत वा चोम्यांनी मेळ्ळें, जाल्यार Mid2-iRFP मेळ्ळें आनी पुराय ईआर पड्ड्यांत (C) वितरीत जालें. (D) आलेखांत धव्या बाण रेशेवयल्यान (दावे वटेन) Gas1-GFP चोम्यांतल्या Gas1-GFP आनी Mid2-iRFP हांची सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता दाखयल्या. एयू, मनमानी एकक. (E आनी F) माल आनी ERES चिन्न एकठांय करपी 3D प्रतिमा दाखयतात. विशिश्ट ईआरईएस लागसार गॅस१-जीएफपी क्लस्टर मेळ्ळे. प्रमाण एकक ०.५५१μm आसता. (F) धवो घन बाण ERES कडेन संबंदीत आशिल्ल्या Gas1-GFP चोम्यांक चिन्न दिता. मदल्या आनी उजव्या पॅनलांत विलीन केल्ली वाडिल्ली 3D प्रतिमा आनी निवडिल्ल्या Gas1-GFP क्लस्टराचें घुंवडायल्लें दृश्य दाखयलां.
Gas1-GFP क्लस्टर आनी विशिश्ट ERES हांचेमदलो लागींचो अवकाशीय संबंद Gas1-GFP निवडक ERES हातूंत प्रवेश करूंक शकता अशें दाखयता, जें Mid2-iRFP कडल्यान ईआर सोडपाखातीर वापरिल्ल्या वेंचणुकेपरस वेगळें आसता. ही शक्यताय सोडोवपा खातीर आमी फकत एका वा दोन वस्तूं खातीर ईआरईएस प्रमाणाचें प्रमाण थारायलें (आकृती 2, अ ते क). चडशा ईआरईएस (70%) हातूंत फकत एकूच प्रकारचो माल आसता अशें आमी पळयलें. आकृती 2C च्या सकयल्या प्रतिमेंत फकत Gas1-GFP (आकृती 1) वा फकत Mid2-iRFP (आकृती 2) आशिल्ल्या ERES ची दोन खाशेली देख दाखयल्या. हाचे उरफाटें सुमार २०% ईआरईएसांत दोन माल आसतात आनी ते एकाच वाठारांत आडखळून पडटात. कांय ईआरएस (१०%) दोन प्रकारचो माल आशिल्ल्याचें दिसून आयलें, पूण ते स्पश्टपणान वेगवेगळ्या वाठारांनी वेगळे केल्ले. देखून ह्या सांख्यिकी विश्लेशणावयल्यान ईआर निर्यात केल्या उपरांत जीपीआय-एपी गॅस१-जीएफपी आनी ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो मिड२-आयआरएफपी हांचे वेगवेगळ्या ईआरईएसांत विभागल्यात अशें दिसून येता (आकृती २डी). ही क्रमवारी कार्यक्षमताय आदल्या जैव रसायनीक विश्लेशणाकडेन (6) आनी आकारिकीनिर्धारणाकडेन (7) खूब जुळटा. तशेंच ईआरईएसांत भितर सरपी क्वारंटायन केल्ल्या मालाची वागणूक आमी पळोवंक शकतात (आकृती 2ई आनी सिनेमा एस2). आकृती 2E दाखयता की Gas1-GFP (पॅनल 3) वा Mid2-iRFP (पॅनल 4) चो फकत एक ल्हानसो भाग एके वटेनच्यान ERES मदीं भितर सरता आनी तो स्वतंत्र वाठारांत बंद जाता. आकृती 2E च्या पॅनल 5 त दाखयलां की Gas1-GFP आनी Mid2-iRFP केन्ना केन्नाय एकाच ERES मदीं मेळटात, पूण ते वेगवेगळ्या वटांनी भितर सरतात आनी वेगवेगळ्या प्रदेशांनी केंद्रीत आसतात जे वेगवेगळ्या COPII पुटिकाांचें प्रतिनिधित्व करूंक शकतात. तशेंच आमी पुष्टी केली की C26 सेरामायड आदारीत GPI-AP Gas1 चें निरिक्षण केल्लें वेगळेपण आनी निवडक ERES म्हणून वर्गीकरण विशिश्ट आसा कारण आनीक एक ट्रान्समेम्ब्रेन स्राव माल, GFP-टॅग केल्लें प्लाझ्मा पड्ड्याचें प्रथिन Axl2 (27 ), Mid2-iRFP सारकें वागणूक दाखयता. (चित्र एस 1 आनी सिनेमा एस 3). नव्यान संश्लेशित केल्लो Axl2-GFP Mid2-iRFP सारकिल्या ER पड्ड्यावरवीं वितरीत जाता (आकृती S1, A आनी B), आनी चडशा ERES मदीं Mid2-iRFP कडेन सह-स्थानीक आसता (आकृती S1, B ते D). आकृती 1 च्या पॅनल 1 आनी 2.S1C हातूंत ERES ची दोन खाशेली देख दाखयल्या जंय दोन पड्ड्याभायर माल आडखळटात. ह्या प्रकरणांत दोनूय माल एकठांय ईआरईएसांत प्रवेश करतात (आकृती S1E, पॅनल 3 आनी मूवी S3).
गॅलॅक्टोज प्रेरक स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, पाचवो) आनी Mid2-iRFP (TMP, निळो) आनी घटक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, magenta) अभिव्यक्त करपी sec31-1 पेशी ° से.चेर 30 मिनटां उब्या केल्या उपरांत 37 तापमानांत दवरून स्राव ब्लॉक सोडपाखातीर 24 ° से २० मिनटां. (अ ते क) मालाची प्रतिनिधीक 2D प्रक्षेपण प्रतिमा (A; स्केल बार, 1μm) वा 3D कोशिक गोलार्ध प्रतिमा (B आनी C; स्केल एकक, 0.456μm) आनी ERES हांणी चिन्न केल्ले 10 z-विभाग. (B) मदलो सकयलो पॅनल आनी (C) मदलो पॅनल फकत ERES (magenta) [Gas1-GFP (राख) आनी Mid2-iRFP (उजवाड निळो)] हातूंत आशिल्लो माल दाखोवपाखातीर प्रक्रिया केल्लीं प्रतिमा दाखयता. (C) उक्तो बाण: ईआरईएस फकत एक मालाची कुडको (1 ते 4) व्हरता. करडो बाण: ईआरईएसांत वेगळो केल्लो माल (5) आसता. धवो घन बाण: सह-स्थानीत माल आशिल्लो ईआरईएस. सकयल: निवडिल्ल्या एकाच ERES हातूंत फकत Gas1-GFP (1) वा Mid2-iRFP (2) आसता. स्केल बार, 100 एनएम. (D) (C) हातूंत वर्णीत केल्ल्या प्रकाशसूक्ष्मचित्राचें प्रमाणीकरण. फकत एक माल (Gas1-GFP वा Mid2-iRFP), वेगळो केल्लो माल आनी आडखळपी माल आशिल्ल्या ईआरईएसची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांत 54 कोशिकांत n=432 अशें दिसून आयलें. त्रुटी पट्टी = एसडी. दोन शेंपडी आशिल्ली जोडी नाशिल्ली टी चांचणी. *** पी = 0.0002. (E) (C) अशें चिन्न केल्ल्या क्वारंटायन केल्ल्या मालाची वेंचून काडिल्ल्या ERES ची 3D प्रतिमा. गॅस१-जीएफपी (पाचवो) (३) वा मिड२-आयआरएफपी (निळो) (४) एके वटेनच्यान ईआरईएस (मॅजेंटा) हातूंत प्रवेश करता आनी ईआरईएसांतल्या ल्हान वाठारांत मर्यादीत आसता. केन्ना केन्नाय दोनूय प्रकारचे माल एकाच वटेनच्यान एकाच ईआरईएस (5) हातूंत प्रवेश करतात आनी ईआरईएसांतल्या एकसुरे वाठारांत मर्यादीत आसतात. स्केल बार, 100 एनएम.
उपरांत आमी एक कल्पना चांचणी केली की ईआर पड्ड्यांत आशिल्लो लांब ऍसिल साखळी सेरामायड (C26) गॅस1 च्या विशिश्ट क्लस्टरिंग आनी क्रमवारीक निवडक ईआरईएसांत व्हरता. हे खातीर आमी GhLag1 ही सुदारीत यीस्ट जात वापरली, तातूंत दोन अंतर्निहित सेरामायड सिंथेज Lag1 आनी Lac1 हांचे सुवातेर GhLag1 (कापसाचो Lag1 होमोलॉग) वापरलो आनी ताका लागून रानटी प्रकारापरस ल्हान कोशिक पड्ड्याचो सेरामाइड जात आशिल्लो यीस्ट जात तयार जालो (आकृती 3A) (28). द्रव्यमान वर्णपटमापन (MS) विश्लेशणावरवीं रानटी प्रकारच्या जातींत वट्ट सेरामायडांतले ९५% खूब लांब (C26) साखळी सेरामायड आसतात, जाल्यार GhLag1 हातूंत ८५% सेरामायड खूब लांब (C18 आनी C16) आसता अशें दिसून आयलें. ), फकत २% सेरामायड खूब लांब (C26) साखळी सेरामायड आसता. आतां मेरेन GhLag1 पड्ड्यांत C18 आनी C16 सेरामायड मेळिल्ले मुखेल सेरामायड आसले तरी GhLag1 जातींत अभिव्यक्त जाल्ल्या Gas1-GFP च्या GPI एंकरांत C26 सेरामायड आशिल्ल्याचीय पुष्टी जाली, जी रानटी प्रकारच्या लिपिडांकडेन तुळा करपासारकी आसा. गुणधर्म तसोच आसता (आकृती ३ अ) (२६). देखून हाचो अर्थ Cwh43 हें सेरामायड रिमॉडेलिंग एंझायम C26 सेरामायडा खातीर खूब निवडक आसता, अशें आकृती 26 त दाखयल्ले प्रमाण तातूंत GhLag1 जातींतल्या C26 सेरामायडाच्या थोड्या प्रमाणांत GPI एंकराचो आस्पाव चड करून जाता. एस२ (२९) हें नांव. तरी लेगीत GhLag1 च्या कोशिक पड्ड्यांत मुळाव्यान फकत C18-C16 सेरामायड आसता, जाल्यार Gas1-GFP हातूंत अजूनय C26 सेरामायड आसता. हे गजालीक लागून ईआरांतल्या पड्ड्याच्या सेरामायडाच्या ऍसिल साखळी लांबायचो प्रस्न खासा सोडोवपाखातीर हो ताण एक आदर्श साधन थारता. वर्ग आनी क्रमवारी हांची कल्पित भुमिका. उपरांत, आमी पयलीं परंपरीक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शकावरवीं sec31-1 च्या तापमान संवेदनशील उत्परिवर्तित एलीलान GhLag1 हातूंत C26 Gas1-GFP च्या चोम्यांनी एकठांय जावपाची तांक अभ्यास केलो, जंय ईआर पड्ड्याच्या सेरामायडांत फकत लांब (C18-C16) साखळी अस्तित्वांत आसता (आकृती 3). आमी पळयलें की sec31-1 हातूंत चडसो Gas1-GFP चोम्यांनी सांद्रीत जाल्लो, जाल्यार लांब (C18-C16) लांब सेरामायड ईआर पड्ड्यावांगडा sec31-1 GhLag1 हातूंतलो Gas1-GFP मुखेलपणान In the entire ER पड्ड्यांत चोम्यांनी आनी वितरीत जावंक नाशिल्लो. अचूक म्हणल्यार C26 सेरामायड आदारीत क्लस्टरिंग विशिश्ट ERES कडेन लागींचो संबंद आशिल्ल्यान (आकृती 1), फुडें आमी हे प्रक्रियेंत ईआर निर्यात प्रथिन यंत्रणेचें कार्यूय आसूं येता काय ना हाची चवकशी केली. जीपीआय-एपी ईआर निर्यात करपाखातीर खाशेली सीओपीआयआय पद्दत वापरता, जी जीपीआय एंकराच्या ग्लायकन भागाच्या Ted1 च्या संरचनात्मक पुनर्रचनेवरवीं सक्रियपणान नियंत्रीत जाता (30, 31). उपरांत पुनर्संयोजीत जीपीआय-ग्लायकॅन ट्रान्समेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 संकुलान वळखतात, जो परतून Lst1 हें निवडून भरती करता, जें मुखेल COPII माल बंधन उपखंड Sec24 चें एक विशिश्ट समरूप आसून, जीपीआय-एपी भरपूर COPII तयार करतात पुटिका गरजेचीं आसतात (31-33). देखून आमी ह्या एकेच प्रथिनांचे (p24 जटिल घटक Emp24, GPI-ग्लायकन रिमॉडेलिंग एंझायम Ted1 आनी विशिश्ट COPII उपखंड Lst1) डिलीशन sec31-1 उत्परिवर्तन जाती वांगडा जोडपी डबल म्युटंट तयार केलो आनी तांचो अभ्यास केलो Is it possible to form Gas1-cluster GFP (आकृती 3). sec31-1emp24Δ आनी sec31-1ted1Δ हातूंत Gas1-GFP मुखेलपणान अक्लस्टर जावन पुराय ईआर पड्ड्यांत वितरीत आसता, अशें आमी पळयलें, जशें sec31-1 GhLag1 हातूंत पयलीं दिसून आयलें, जाल्यार sec31-1lst1Δ हातूंत Gas1-GFP Like sec31-1. ह्या निकालांक लागून ईआर पड्ड्यांत C26 सेरामायड आशिल्ल्यावांगडाच Gas1-GFP च्या चोम्यांक p24 संकुलाक बंधन जावपाचीय गरज आसता, आनी ताका विशिश्ट Lst1 भरती करपाची गरज ना अशें दिसून येता. उपरांत, ईआर पड्ड्यांतल्या सेरामायडाची साखळी लांबाय Gas1-GFP च्या p24 कडेन आशिल्ल्या बंधनाचें नियंत्रण करपाक शकता अशी शक्यताय आमी सोदून काडली. पूण पड्ड्यांत C18-C16 सेरामायड आशिल्ल्यान p24 संकुलान (आकृती S3 आनी S4, A आनी B) पुनर्रचना केल्ल्या जीपीआय-ग्लायकॅनांचेर वा जीपीआय-एपीकडेन बंधन जावन जीपीआय-एपी निर्यात करपी जीपीआय-ग्लायकॅनांचेर परिणाम जायना अशें आमी पळयलें. क्षमता. COPII उपप्रकार Lst1 (आकृती S4C) भरती करप. देखून C26 सेरामायड-आदारीत क्लस्टरिंगांत वेगवेगळ्या ईआर निर्यात प्रथिन यंत्रणेकडेन प्रथिन परस्पर क्रिया करपाची गरज नासता, पूण लिपिड लांबायेक लागून चलपी पर्यायी क्रमवारी यंत्रणेक आदार मेळटा. उपरांत, गॅस1-जीएफपीचें निवडक ईआरईएस म्हणून प्रभावी वर्गीकरण करपाखातीर ईआर पड्ड्यांतली सेरामायड ऍसिल साखळी लांबाय म्हत्वाची आसा काय ना हाचें आमी विश्लेशण केलें. लघुसाखळीच्या सेरामायड आशिल्ल्या GhLag1 जातींतलो Gas1 ईआर सोडून प्लाझ्मा पड्ड्यांत भितर सरता देखून (आकृती S5) सेरामायड ऍसिल साखळीचे लांबायेन क्रमवारी केल्यार GhLag1 जातींतलो Gas1 परतून दिश्टी दिवन पार करूं येता अशें आमी मानतात. त्याच पड्ड्याचो ईरेस माल.
(A) GhLag1 च्या कोशिका पड्ड्यांत मुखेलपणान ल्हान C18-C16 सेरामायड आसतात, जाल्यार Gas1-GFP च्या GPI एंकरांत अजूनय रानटी प्रकारच्या पेशींभशेन C26 IPC आसता. वयर: रानटी प्रकारच्या (Wt) आनी GhLag1p जातीच्या कोशिका पड्ड्यांतल्या सेरामायडाचें द्रव्यमान वर्णपटमापन (MS) पद्दतीन ऍसिल साखळी लांबायचें विश्लेशण. डेटा वट्ट सेरामायडाची टक्केवारी दाखयता. तीन स्वतंत्र प्रयोगांची सरासरी. त्रुटी पट्टी = एसडी. दोन शेंपडी आशिल्ली जोडी नाशिल्ली टी चांचणी. **** पी <0.0001. तळाचो पॅनल: रानटी प्रकार आनी GhLag1p जातींनी अभिव्यक्त केल्ल्या Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI एंकरांत आशिल्ल्या IPC च्या ऍसिल साखळी लांबायचें MS विश्लेशण. डेटा वट्ट आयपीसी संकेताची टक्केवारी दाखयता. पांच स्वतंत्र प्रयोगांची सरासरी. त्रुटी पट्टी = एसडी. दोन शेंपडी आशिल्ली जोडी नाशिल्ली टी चांचणी. ns, म्हत्वाचें न्हय. पी = ०.९१३४ इतलें आसता. (B) गॅलॅक्टोज प्रेरीत Gas1-GFP अभिव्यक्त करपी sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ आनी sec31-1lst1Δ पेशींचे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मचित्र 37 सॅ २४ सॅ. धवो बाण: ईआर गॅस1-जीएफपी क्लस्टर. उक्तो बाण: अक्लस्टर केल्लो गॅस1-जीएफपी पुराय ईआर पड्ड्याचेर वितरीत जाता, तातूंत ईआर खाशेलपण आशिल्लें अणुकेंद्रीय रिंग रंगीतपण दाखयलां. स्केल बार, 5μm. (C) (B) हातूंत वर्णीत केल्ल्या प्रकाशसूक्ष्मचित्राचें प्रमाणीकरण. विरामयुक्त Gas1-GFP संरचना आशिल्ल्या पेशींची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांत n≥300 पेशी. त्रुटी पट्टी = एसडी. दोन शेंपडी आशिल्ली जोडी नाशिल्ली टी चांचणी. **** पी <0.0001.
ही समस्या थेट सोडोवपाखातीर आमी sec31-1 तापमान संवेदनशील उत्परिवर्तित एलीलावांगडा GhLag1 हातूंतल्या Gas1-GFP आनी Mid2-iRFP चें SCLIM व्हिज्युअलायझेशन केलें (आकृती 4 आनी मूवी S4). ईआर ३७ सॅ.तापमानाचेर दवरल्या उपरांत आनी उपरांत २४ सॅ. तेभायर ईआरईएसच्या व्हड टक्केवारींत (६७%) तातूंत सह-स्थान आशिल्ल्या दोन प्रकारच्या मालाचो आस्पाव जाता (आकृती ४ डी). आकृती 4C च्या पॅनल 1 आनी 2 त Gas1-GFP आनी Mid2-GFP आडखळपी ERES ची दोन खाशेली देख दाखयल्या. ते भायर दोनूय माल एकाच ईआरईएसांत भरती केल्ले (आकृती 4ई, पॅनल 3 आनी सिनेमा एस4). देखून आमच्या निकालांतल्यान ईआर पड्ड्यांतल्या सेरामायड ऍसिल साखळीची लांबाय ही ईआर प्रथिन एकठांय करपाचो आनी वर्गीकरण करपाचो म्हत्वाचो निर्धारक अशें दिसून येता.
गॅलॅक्टोज-प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, पाचवो) आनी Mid2-iRFP (TMP, निळो) आनी घटक ERES-लेबल केल्ली Sec13-mCherry (ERES, magenta) अभिव्यक्त करपी Sec31-1 GhLag1 पेशी 37 सॅ. 30 मिनटां चालू दवरून, स्राव सोडपाखातीर 24 सॅ. (अ ते क) माल आनी ईआरईएस हांणी चिन्न केल्ल्या १० z-विभागांची प्रतिनिधीक 2D प्रक्षेपण प्रतिमा (A; स्केल बार, 1μm) वा 3D कोशिक गोलार्ध प्रतिमा (B आनी C; स्केल एकक, 0.45μm). (B) मदलो सकयलो पॅनल आनी (C) मदलो पॅनल फकत ERES (magenta) [Gas1-GFP (राख) आनी Mid2-iRFP (उजवाड निळो)] हातूंत आशिल्लो माल दाखोवपाखातीर प्रक्रिया केल्लीं प्रतिमा दाखयता. (C) धवो भरिल्लो बाण: ERES, माल आडखळ. उक्तो बाण: ERES हातूंत फकत एकूच वस्तू आसता. सकयलो पॅनल: निवडिल्ल्या ईआरईएसांत (C) त चिन्नीत आडखळपी माल (1 आनी 2) आसता. स्केल बार, 100 एनएम. (D) (C) हातूंत वर्णीत केल्ल्या प्रकाशसूक्ष्मचित्राचें प्रमाणीकरण. sec31-1 आनी sec31-1 GhLag1 युनिटांत फकत एक माल (Gas1-GFP वा Mid2-iRFP) आस्पावतात, आनी वेगळे केल्ल्या माल आनी आडखळपी मालाखातीर ERES ची सरासरी टक्केवारी. तीन स्वतंत्र प्रयोगांत 54 कोशिकांत (sec31-1) n = 432 आनी 47 कोशिकांत (sec31-1 GhLag1) n = 430 अशें दिसून आयलें. त्रुटी पट्टी = एसडी. दोन शेंपडी आशिल्ली जोडी नाशिल्ली टी चांचणी. *** पी = 0.0002 (सेकंद31-1) आनी ** पी = 0.0031 (सेकंद31-1 GhLag1). (E) (C) हातूंत चिन्नीत केल्ल्या आडखळपी मालाची (3) निवडिल्ल्या ERES ची 3D प्रतिमा. गॅस१-जीएफपी (पाचवो) आनी मिड२-आयआरएफपी (निळो) एकाच वटेनच्यान ईआरईएस (मॅजेंटा) कडेन वतात आनी एकाच ईआरईएस प्रतिबंधीत वाठारांत रावतात. स्केल बार, 100 एनएम.
ह्या अभ्यासावरवीं लिपिड आदारीत प्रथिन मालाचे स्रावी मार्गांतल्या निवडक निर्यात सुवातींनी वर्गीकरण केल्ल्याचो थेट विव्हो पुरावो मेळटा आनी वर्गीकरण वेंचणुकेखातीर ऍसिल साखळी लांबायचें म्हत्व उक्तें जाता. SCLIM नांवाच्या बळिश्ट आनी अत्याधुनीक सूक्ष्मदर्शक तंत्राचो उपेग करून आमी नव्यान संश्लेशित केल्लें Gas1-GFP (एक मुखेल प्लाझ्मा पड्डो GPI-AP with a very long acyl chain (C26) ceramide lipid portion) हें यीस्टांत दाखयलें ) स्वतंत्र ईआरांत एकठांय जाल्ले प्रदेश विशिश्ट ERES कडेन संबंदीत आसतात, जाल्यार पड्ड्याभायर स्रावीत प्रथिनां पुराय ईआर पड्ड्यांत वितरीत जातात (आकृती १) हें नांव. तेभायर हे दोन प्रकारचे माल वेगवेगळ्या ईआरईएसांत निवडून प्रवेश करतात (आकृती 2). पड्ड्यांतल्या कोशिकीय सेरामायडाची ऍसिल साखळी लांबाय C26 ते C18-C16 मेरेन उणी जाता, Gas1-GFP चोमो स्वतंत्र ईआर प्रदेशांत खंडीत जाता आनी Gas1-GFP हें त्याच ERES वरवीं पड्ड्याभायर आशिल्ल्या प्रथिनावांगडा ईआर सोडपाखातीर परतून मार्ग काडटात (आकृती 3 आनी आकृती 3). ४).
जीपीआय-एपी ईआरांतल्यान भायर सरपाखातीर एक खाशेली प्रथिन यंत्रणा वापरता तरी सी२६ सेरामायडाचेर आदारीत वेगळेपण ईआरईएस विशेशीकरण जावंक शकता अशा विभेदक प्रथिन परस्पर क्रियांचेर आदारून ना अशें आमी पळयलें (आकृती एस ४ आनी एस५). ताचे बदला आमच्या सोदांतल्यान लिपिड आदारीत प्रथिनांचो चोमो आनी उपरांत हेर माल वगडावप हाका लागून चलपी पर्यायी वर्गीकरण यंत्रणेक आदार मेळटा. आमच्या निरिक्षणांतल्यान दिसून येता की एका विशिश्ट ERES कडेन संबंदीत Gas1-GFP प्रदेशांत वा चोम्यांत ट्रान्समेम्ब्रेन स्रावीत प्रथिन Mid2-iRFP ना, जें दाखयता की C26 सेरामायड-आदारीत GPI-AP चोम्यांतल्यान तांकां संबंदीत ERES हातूंत प्रवेश मेळटलो, आनी त्याच वेळार, ट्रान्समेम्ब्रेन वगळटात स्राव ह्या खाशेल्या ERES हातूंत प्रवेश करतात (आकृती 1 आनी 2). हाचे उरफाटें ईआर पड्ड्यांत सी१८-सी१६ सेरामायड आशिल्ल्यान जीपीआय-एपीक प्रदेश वा चोमे तयार जायनात, देखून ते पड्ड्याभायर स्रावीत प्रथिनां त्याच ईआरईएसांत वगळनात वा ताचे सुवातेर बदलनात (आकृती ३ आनी ४). . देखून आमी प्रस्तावीत करतात की C26 सेरामायड विशिश्ट ईआरईएस कडेन संबंदीत आशिल्ल्या प्रथिनांचे चोम्यांची सुवीधा दिवन वेगळेपण आनी वर्गीकरण चालीक लायता.
विशिश्ट ईआर वाठारांत हें C26 सेरामायड-आदारीत क्लस्टरिंग कशें साध्य करप? पड्ड्याच्या सेरामायडाची बाजूक वेगळी जावपाची प्रवृत्ती आशिल्ल्यान जीपीआय-एपी आनी सी२६ सेरामायड हांचेपसून ल्हान आनी असंतृप्त ग्लिसरॉललिपिड आशिल्ल्या ईआर पड्ड्याच्या चड अनियमित लिपिड वातावरणांत ल्हान आनी क्षणीक क्रमबध्द लिपिड तयार जावंक शकतात. गुणवत्तेचे चोम्य (17, 18). हे ल्हान तात्पुरते चोम्य p24 संकुलाक बंधन जाले उपरांत आनीक व्हड, चड स्थिर चोम्यांनी विलीन करूं येतात (34). हाचेकडेन जुळपी आमी दाखयलें की C26 Gas1-GFP हें p24 संयुगाकडेन संपर्क सादून व्हड दृश्य चोम्यांनी तयार करपाची गरज आसा (आकृती 3). p24 संकुल हो यीस्टांतल्या चार वेगवेगळ्या p24 ट्रान्समेम्ब्रेन प्रथिनांनी तयार जाल्लो विषमयुग्मज ऑलिगोमर आसता (35), जो बहुसंयोजी बंधन दिता, जाका लागून ल्हान जीपीआय-एपी चोम्यांचें क्रॉस-लिंकिंग जावंक शकता, जाका लागून व्हड Stable चोमो तयार जाता (34). जीपीआय-एपीच्या प्रथिन बाह्यक्षेत्रांमदली परस्पर क्रियाय तांच्या एकठांय जावपाक योगदान दिवंक शकता, अशें सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींत तांच्या गोल्गी येरादारी वेळार दिसून येता (36). पूण जेन्ना ईआर पड्ड्यांत C18-C16 सेरामायड आसता तेन्ना p24 संकुल Gas1-GFP कडेन बंधन जाता तेन्ना व्हड वेगवेगळे चोमे तयार जावचे नात. लांब ऍसिल साखळी आशिल्ल्या सेरामायडाच्या विशिश्ट भौतिक आनी रसायनीक गुणधर्मांचेर मुळावी यंत्रणा आदारून आसूं येता. कृत्रीम पड्ड्यांच्या जैव भौतिक अभ्यासावयल्यान लांब (C24) आनी ल्हान (C18-C16) ह्या दोनूय प्रकारच्या ऍसिल साखळीच्या सेरामायडाक लागून जरी फेज वेगळेपण जावंक शकता तरी फकत लांब ऍसिल साखळी आशिल्ल्या सेरामायडांक (C24) उच्च वक्रताय आनी फिल्म वांकून फिल्माचो नवो आकार दिवंक शकता अशें दिसून येता. परस्पर संदर्भावरवीं (१७, ३७, ३८). Emp24 चो मनशाचो समरूप TMED2 चो ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्स सायटोप्लाझ्मीक लोब्युलांतल्या C18 सेरामायड आदारीत स्फिंगोमायलीनाकडेन निवडून संपर्क सादता अशें दाखयलां (39). रेणूगतिकी (MD) अनुकरणां वापरून आमी C18 आनी C26 हे दोनूय सेरामायड Emp24 ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्साच्या सायटोप्लाझ्मीक लोब्युला भोंवतणी जमतात आनी तांकां सारकेच पसंती आशिल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती S6). हाचेवयल्यान Emp24 च्या ट्रान्समेम्ब्रेन हेलिक्साक लागून पड्ड्यांतल्या लिपिडांचें असममित वितरण जावंक शकता अशें दिसून येता हें लक्षांत घेवपासारकें आसा. सस्तन प्राण्यांच्या पेशींचेर आदारिल्लो हो हालींचो निकाल. अशाच प्रकारच्या एमडी अनुकरणांतल्यानय ईथर लिपिडांची उपस्थिती दिसून येता (40) . देखून ईआर२६ च्या दोन लोब्युलांतलें सी२६ सेरामायड थळाव्या प्रमाणांत समृध्द आसा असो आमी अदमास काडटात. जेन्ना लुमिनल लोब्युलांतलो जीपीआय-एपी थेट बहुसंयोजी पी२४ कडेन बंधन जाता आनी सायटोप्लाझ्मीक लोब्युलांतल्या पी२४ भोंवतणी सी२६ सेरामायड एकठांय जाता तेन्ना ताका लागून ताचे वांगडा आशिल्ल्या प्रथिन एकठांय जावपाक चालना मेळूंक शकता आनी बोटांतल्यान पड्ड्याची वक्रताय निर्माण जाता (४१), जाका लागून जीपीआय-एपी ईआरईएसाक लागीं आशिल्ल्या विच्छिन्न प्रदेशांनी वेगळे जातात, जें चड वक्र आशिल्ल्या भागांकय फाव जाता ईआर पड्ड्याच्या प्रदेशांत (42). आदल्या अहवालांनी प्रस्तावीत यंत्रणेक तेंको दिल्लो (43, 44). प्लाझ्मा पड्ड्याचेर ऑलिगोलॅक्टिन, रोगजंतू वा प्रतिपिंडांचें सेरामायड आदारीत ग्लायकोस्फिंगोलिपिड (GSL) हांचेकडेन बहुसंयोजी बंधन जावन व्हड जीएसएल एकठांय जावपाक सुरवात जाता, फेज वेगळेपण वाडटा आनी पड्ड्याची विकृतताय आनी अंतर्गतीकरण जाता (44). इवाबुची आदी (43) लांब (C24) पूण ल्हान न्हय (C16) ऍसिल साखळींच्या आशिल्ल्यान जीएसएल लॅक्टोसिलसेरामायडाक बांदिल्ल्या बहुसंयोजी लिगांडाक लागून व्हड चोमे आनी पड्ड्याची घुस्पागोंदळ तयार जाता आनी पत्र्यांचेर लीन-मध्यस्थीकृत संकेत संप्रेषण जोडिल्ल्या ऍसिल साखळींवरवीं परस्पर विभाजीत जाता अशें दिसून आयलें न्यूट्रोफिलस हें वखद.
सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींत एपिकल प्लाझ्मा पड्ड्याच्या पातळेमेरेन अँटी-गोल्गी जाळयेची (TGN) सांद्रताय जीपीआय-एपीच्या वेगळेपणाचेर आनी क्रमवारीचेर नियंत्रण दवरता (10, 45). हें एकठांयपण जीपीआय-एपी ऑलिगोमेरायझेशनाक लागून जाता (36), पूण तें आमी यीस्टांत मेळपी सेरामायड साखळी लांबायचेरूय आदारून आसूं येता. सस्तन प्राण्यांच्या जीपीआय-एपींत ईथर लिपिड आदारीत नांगर आसता, आनी ताची रसायनीक संरचना खूब लांब ऍसिल साखळी आशिल्ल्या सेरामायडापरस खूब वेगळी आसली तरी हालींच्या अभ्यासांत दोनूय लिपिडांचे उत्क्रांतीचे नदरेन सारकेच भौतिक आनी रसायनीक गुणधर्म आनी कार्य आशिल्ल्याचें दिसून आयलां (40). देखून सस्तन प्राण्यांच्या पेशींतलो ईथर लिपिड भाग यीस्टांतल्या सी२६ सेरामायडासारको आसूं येता आनी जीपीआय-एपी एकठांय करपाक आनी क्रमवारी करपाक चालना दिवपाखातीर पड्ड्यांतल्या लांब साखळीच्या सेरामायडाकडेन संबंद जोडप ही ताची भुमिका आसता. ही शक्यताय अजूनय थेट चांचणी करपाची गरज आसली तरी लांब ऍसिल साखळी आशिल्ल्या सेरामायडाची गोल्गी कुडींत येरादारी सायटोप्लाझ्मीक हस्तांतरण प्रथिनांनी जायना, पूण यीस्टासारक्या जीपीआय नांगरांच्या संश्लेशणाचेर आदारून आसता अशें आदल्या सोदांतल्यान मेळ्ळां. देखून उत्क्रांतीवादी पुरातनवादी यंत्रणा एकाच येरादारी पुटिकांत खूब लांब ऍसिल साखळी सेरामायड आनी जीपीआय-एपी (13, 16, 20, 46, 47) हांची निवडक सह-वाहन करपाक शकता अशें दिसता.
यीस्ट आनी सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशी प्रणालींत जीपीआय-एपी एकठांय जावप आनी हेर प्लाझ्मा पड्ड्याच्या प्रथिनांतल्यान वेगळेपण हें सगळें कोशिकेच्या पृश्ठाचेर पावचे पयलीं जाता. पॅलाडिनो आनी हेर हांणी 1960 वर्सा एस. (48) हांणी सस्तन प्राण्यांच्या ध्रुवीकृत उपकला पेशींच्या टीजीएनचेर जीपीआय-एपी क्लस्टरिंग फकत जीपीआय-एपीचें एपिकल प्लाझ्मा पड्ड्याक निवडक वर्गीकरण करपाखातीर गरजेचें न्हय, तर जीपीआय-एपींच्या क्लस्टरिंग संघटनेचें आनी ताची जैविक क्रियाशीलताय नियंत्रीत करता अशें दिसून आयलें. कोशिका पृश्ठभागाचेर. यीस्टांत ह्या अभ्यासांत ईआरचेर आशिल्लो सी२६ सेरामायड-आदारीत जीपीआय-एपी चोमो प्लाझ्मा पड्ड्याचेर जीपीआय-एपीची चोम्यांची संघटना आनी कार्यात्मक क्रिया नियंत्रीत करूंक शकता अशें दिसून आयलें (२४, ४९). ह्या मॉडेलाकडेन जुळपी GhLag1 पेशींक GPI प्रतिबंधक वा पेशी वण्टीच्या अखंडतेचेर परिणाम करपी वखदांकडेन ॲलर्जी आसता (28), आनी यीस्ट पेशींच्या संभोगांत प्रक्षेपित केल्ल्या तोंक सेरामायडाच्या कार्यात्मक Gas1-GFP चोम्यांची (49) गरज जी hLag1 पेशींचे संभाव्य शारिरीक परिणाम दाखयतात. जीपीआय-एपी त्रुटी. पूण लिपिड लांबायचेर आदारीत क्रमवारी पद्दतीन कोशिकेच्या पृश्ठाची कार्यात्मक संघटना ईआर कडल्यान प्रोग्राम केल्या काय ना हाची फुडली चांचणी करप हो आमच्या फुडल्या संशोधनांतलो विशय आसतलो.
ह्या वावरांत वापरिल्ल्या सॅकॅरोमायसीस सेरेव्हिसिया जातींची वळेरी कोश्टक S1 त दिल्या. जिव्या पेशी प्रतिमेखातीर एससीएलआयएमचे एमएमवाय१५८३ आनी एमएमवाय१६३५ जाती डब्ल्यू३०३ च्या फाटभूंयेर तयार केल्ले. प्रतिदीप्त प्रथिन टॅगान Sec13-mCherry अभिव्यक्त करपी हे जाती पॉलिमरेझ साखळी विक्रिया (PCR) आदारीत पद्दत वापरून pFA6a प्लाझ्मीड साचा म्हणून तयार केल्ले (23). GAL1 प्रवर्तकाच्या नियंत्रणाखाला प्रतिदीप्त प्रथिनान लेबल केल्लो Mid2-iRFP अभिव्यक्त करपी जात फुडले तरेन तयार केलो. pKTiRFP-KAN व्हॅक्टरांतल्यान iRFP-KanMx क्रमाचें पीसीआर प्रवर्धन (ई. ओ'शी, अॅडजीन प्लाझ्मीड क्रमांक 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; संशोधन संसाधन वळखपी (RRID): Addgene_64687) आनी अंतर्निहित Mid2 च्या C-टर्मिनसांत घालून. Mid2-iRFP जीनोम क्रम प्रवर्धित करून GAL1 प्रवर्तकांत क्लोन केल्या उपरांत ताचें एकठांयीकरण प्लाझ्मीड pRS306 च्या Not I-Sac I स्थळार एकठांय केलें. तातूंतल्यान मेळिल्ल्या प्लाझ्मीड pRGS7 चें Pst I कडेन रेखीव करून URA3 स्थानांत एकठांय केलें.
Gas1-GFP संलयन जनुक GAL1 प्रवर्तकाच्या नियंत्रणाखाला सेंट्रोमेर (CEN) प्लाझ्मीडांत अभिव्यक्त जाता आनी ताची रचना अशी जाता. Gas1-GFP क्रम pRS416-GAS1-GFP प्लाझ्मीड (24) (L. Popolo ची भेट) हाचेपसून पीसीआर पद्दतीन प्रवर्धित करून CEN प्लाझ्मीड pBEVY-GL LEU2 (C ची भेट) च्या Xma I–Xho I स्थळार क्लोन केलो. मिलर आनी डी. अॅडजीन प्लाझ्मीड क्रमांक ५१२२५; http://n2t.net/addgene: 51225 ह्या संकेतथळार; आरआरआयडी: अॅडजीन_51225). तातूंतल्यान मेळिल्ल्या प्लाझ्मीडाक pRGS6 अशें नांव दिलें. तशेंच Axl2-GFP संलयन जनुक pBEVY-GL LEU2 वाहकाच्या GAL1 प्रवर्तकाच्या नियंत्रणाखाला अभिव्यक्त जाता आनी ताची बांदावळ अशी आसता. Axl2-GFP क्रमांक pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाझ्मीड (23) पासून पीसीआर पद्दतीन प्रवर्धित केलो, आनी pBEVY-GL LEU2 व्हॅक्टराच्या Bam HI-Pst I स्थळार क्लोन केलो. तातूंतल्यान मेळिल्ल्या प्लाझ्मीडाक pRGS12 अशें नांव दिलें. ह्या अभ्यासांत वापरिल्ल्या ऑलिगोन्युक्लिओटायडांचो क्रम कोश्टक S2 त दिला.
ह्या जातींत ०.२% एडेनिन आनी २% ग्लुकोज [YP-dextrose (YPD)], २% रॅफिनोज [YP-raffinose] भरपूर यीस्ट अर्क प्रथिन पी (YP) माध्यम (१ % यीस्ट अर्क आनी २% प्रथिन ept) पुरवण केल्ली. (YPR)] वा २% गॅलॅक्टोज [YP-गॅलॅक्टोज (YPG)] कार्बन स्त्रोत म्हणून, वा कृत्रीम उण्यांत उण्या माध्यमांत (०.१५% यीस्ट नायट्रोजन बेस आनी ०.५% अमोनियम सल्फेट) पोशणा खातीर गरजेच्या फावो त्या अॅमिनो अॅसिड आनी क्षारक पूरक करपाखातीर , आनी तातूंत २% ग्लुकोज (सिंथेटिक ग्लुकोज उण्यांत उणें माध्यम) वा २% गॅलॅक्टोज आसता (संश्लेशीत गॅलॅक्टोज उण्यांत उणें माध्यम) हें कार्बन स्त्रोत म्हणून वापरतात.
रियल-टायम इमेजिंग करपाखातीर GAL1 प्रवर्तकाखाला रचना अभिव्यक्त करपी तापमान संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्तित पेशी वायपीआर माध्यमांत 24 सॅ.तापमानाचेर रातभर लॉग फेज मेरेन वाडयल्यो. २४ सॅ.तापमानाचेर वायपीजींत १ वरां प्रेरीत केल्या उपरांत पेशी एसजींत ३७ सॅ.तापमानाचेर ३० मिनटां दवरून, उपरांत २४ सॅ. कंवचेच्या स्लाइडीचेर पेशी स्थिर करपाखातीर कॉनकानाव्हॅलिन एचो उपेग केलो आनी एससीएलआयएम वरवीं प्रतिमा तयार केली. SCLIM हो ऑलिंपस IX-71 उलटयल्लो प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शक आनी UPlanSApo 100×1.4 संख्यात्मक रंध्र तेल भिंग (Olympus), उच्च गतीचो आनी उच्च-सिग्नल-टू-नॉयज रेशियो घुंवपी डिस्क कॉनफोकल स्कॅनर (Yokogawa Electric), कसटम स्पॅक्ट्रोमीटर आनी कसटम थंड करप हांचो मेळ आसा The system's image intensifier (Hamamatsu फोटोनिक्स) हातूंत ×२६६.७ हें निमाणें विवर्धन आशिल्ली भिंग प्रणाली आनी इलॅक्ट्रॉनांक गुणाकार करपी आघात-युग्मित साधन कॅमेरो (हामामात्सु फोटोनिक्स) (21) दिवंक शकता. प्रतिमा संपादन सानुकूल सॉफ्टवेअर (योकोगावा इलॅक्ट्रीक) वरवीं जाता. 3D प्रतिमांखातीर आमी उद्देश भिंगाक उब्या वटेन कंपन करपाखातीर कसटम तयार केल्लो पीझोइलॅक्ट्रीक एक्ट्यूएटर वापरलो आनी प्रकाशीय भाग 100 एनएम अंतराचेर एका स्टॅकांत एकठांय केले. झॅड-स्टॅक प्रतिमेचें 3D व्हॉक्सेल डेटांत रुपांतर करतात आनी घुंवपी डिस्क कॉनफोकल मायक्रोस्कोपाखातीर वापरिल्ल्या सैध्दांतिक बिंदू प्रसार कार्याचो उपेग व्होलोसिटी सॉफ्टवेअर (पर्किनएलमर) हाणें डिकॉन्व्हॉल्यूशन प्रक्रिया करपाखातीर करतात. सह-स्थान विश्लेशणा खातीर आपोआप थ्रेशोल्ड करपाक व्होलोसिटी सॉफ्टवेअर वापरून माल सयत ईआरईएस मेजले. मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर (Molecular Devices) वापरून लायन स्कॅन विश्लेशण केलें.
सांख्यिकी म्हत्व थारावपाखातीर GraphPad Prism सॉफ्टवॅर वापरात. दोन शेंपडी आशिल्ल्या स्टुडंट टी-परीक्षा आनी सादारण एकतरफा व्हेरिएन्स विश्लेशण (ANOVA) चांचणेखातीर गटांतल्या फरकांक लागून P <0.05 (*) हाचेर म्हत्वाचो परिणाम जाता अशें मानतात.
Gas1-GFP च्या प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शकाखातीर लॉग फेज पेशी वायपीडींत रातभर वाडोवन अपक्षेपणावरवीं एकठांय करून फॉस्फेट बफर केल्ल्या खारें उदकान दोन फावटीं धुवन बर्फाचेर उण्यांत उणें 15 मिनटां उब्यो दवरल्यो आनी उपरांत पयलीं वर्णन केल्लेप्रमाण सूक्ष्मदर्शकाखाला फुडें व्हेल्यो चेक (24). ऑब्जॅक्टिव्ह लेन्स, एल 5 (जीएफपी) फिल्टर, हामामात्सू कॅमेरो आनी अॅप्लिकेशन सुट एक्स (LAS X) सॉफ्टवेअर हांणी सज्ज आशिल्लो लायका डीएमआय8 सूक्ष्मदर्शक (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) हें संपादन करपाखातीर वापरलें. .
नमुन्यांचे एसडीएस नमुनो बफरान ६५ सॅ.तापमानाचेर १० मिनटां विकृत करून उपरांत एसडीएस-पॉलीऍक्रेलामायड जेल विद्युत् संचलन (PAGE) पद्दतीन वेगळे केल्ले. इम्युनोब्लॉटिंग विश्लेशणाखातीर दर लेनांत १० μl नमुनो लोड केलो. प्राथमिक प्रतिपिंड: कांसवाचें पॉलीक्लोनल अँटी-गॅस१ हें १:३००० पातळ करप, कांसवाचें पॉलीक्लोनल अँटी-Emp24 हें १:५०० पातळ करप आनी कांसवाचें पॉलीक्लोनल अँटी-जीएफपी (एच. रिझमन हाचें भेटवस्तू) हें १:३००० पातळ करप. मुयाच्या मोनोक्लोनल अँटी-पीजीके१ प्रतिपिंडाची १:५००० पातळ करप (जे. द ला क्रूझ हाची भेट) वापरली. दुय्यम प्रतिपिंड: हॉर्सरॅडिश पेरॉक्सिडायज (HRP) संयुगित बोकड्याचें अँटी-रॅबिट इम्युनोग्लोबुलिन जी (IgG) हें १:३००० पातळीकरणांत वापरतात (पियर्स). एचआरपी-संयुग्मित बोकड्यांच्या मुयाच्या विरोधी आयजीजीचो उपेग १:३००० (पियर्स) पातळ करपाचेर केलो. सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिक्रियाकारक (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) ह्या रसायनीक प्रकाशमान पद्दतीन रोगप्रतिकार प्रतिसाद क्षेत्र निरिक्षण केलो.
(31) हातूंत वर्णन केल्लेप्रमाण समृध्द केल्ल्या ईआर अंशाचेर सैमीक प्रतिरक्षी अवक्षेपण प्रयोग केलो. थोडयाच उतरांनी यीस्ट पेशी TNE बफर [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM फिनायलमिथिलसल्फोनिल फ्लोराइड आनी प्रोटीज प्रतिबंधक मिश्रण) 600 nm ( OD600) 100 प्रकाशीय घनतेचेर दोन फावटीं धुवप. कंवचेच्या मणींनी तो मोडलो आनी उपरांत कोशिकांचो कोळसो आनी कंवचेचे मणी अपकेंद्रीकरण करून काडून उडयले. उपरांत सुपरनॅटॅंट 17,000 ग्रॅम तापमानांत 15 मिनटां 4 सॅ. गोळी परतून टीएनईंत स्थलांतरीत करून निमाणें १% सांद्रतायेमेरेन डिजिटलिस सॅपोनिन घालें. हें निलंबन ४ सॅ.तापमानाचेर घुंवडावन १ वरां उबें दवरलें आनी उपरांत ४ सॅ.तापमानाचेर १३,००० ग्रॅ. Gas1-GFP प्रतिरक्षी अवक्षेपणाखातीर पयलीं नमुनो रिकाम्या अॅगरोज मणी (ChromoTek) च्या आदारान 4 सॅ. प्रतिरक्षी अवक्षेपीत मणी ०.२% डायगोक्सिजेनिन आशिल्ल्या टीएनईन पांच फावटीं धुवन एसडीएस नमुनो बफरान विरगळून एसडीएस-पीएजीईचेर वेगळे करून इम्युनोब्लॉटींग पद्दतीन विश्लेशण केलें.
(31) हातूंत वर्णन केल्लेप्रमाण समृध्द केल्ल्या ईआर अंशाचेर क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण केलें. थोडयाच उतरांनी समृध्द केल्ल्या ईआर अंशाक ०.५ मिमी. ग्लायसीन (५० मिमी.निमाणी सांद्रताय, ५ मिनटां, २० सॅ.) घालून क्रॉसलिंकिंग विक्रिया शांत केली.
आदीं वर्णन केल्लेप्रमाण (50) रानटी प्रकार आनी GhLag1 जातींनी सेरामायडाचें एमएस विश्लेशण केलें. थोडयाच उतरांनी सांगपाचें जाल्यार वायपीडींत ३० सॅ. तांचें चयापचय ट्रायक्लोरोएसिटिक आम्लान शांत जाता. काडपाचें विरयण [इथेनॉल, उदक, ईथर, पिरिडीन आनी ४.२ एन अमोनियम हायड्रॉक्सायड (१५:१५:५:१:०.०१८ v/v)] आनी १.२ एनएमओएल अंतर्गत मानक सी१७ सेरामायड (८६०५१७, अवंटी ध्रुवीय लिपिड) दर्ज्याचो वापर करचो. अर्काचें सौम्य क्षारीय जलविघटन करपाखातीर मोनोमिथिलामायन अभिक्रियाकारक [मेथॅनॉल, उदक, एन-ब्युटानॉल आनी मिथिलामायन विरय (4:3:1:5 v/v)] वापरात आनी उपरांत उदकांत संतृप्त एन-ब्युटानॉल वापरून मीठ काडून उडोवचें. निमाणें अर्क पॉझिटिव्ह मोड विरयणात [क्लोरोफॉर्म/मेथॅनॉल/उदक (2:7:1) + 5 मिमी.अमोनियम ऍसिटेट] परतून स्थलांतरीत करून द्रव्यमान वर्णपटमापकांत इंजेक्शन दिलो. स्फिंगोलिपिड रेणू वळखुपाखातीर आनी ताचें प्रमाण थारावपाखातीर बहु-विक्रिया निरिक्षण (MRM) केलें. टीएसक्यू व्हॅंटेज तृतीय चतुर्ध्रुवीय द्रव्यमान वर्णपटमापक (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) हातूंत लिपिड विश्लेशणाखातीर रोबॉट नॅनोफ्लो आयन स्त्रोत नॅनोमेट एचडी (एडव्हियन बायोसायन्सेस, इथाका, एनवाय) आसता. दर एका सेरामायड वर्गाखातीर टक्कर ऊर्जा अनुकूल केल्ली आसता. एमएस डेटा पॉझिटिव्ह मोडांत मेळयलो. दर एका जैविक प्रतिकृतीखातीर लिपिड संकेत हो तीन स्वतंत्र मापांचें मध्यवर्ती आसता.
(31) हातूंत वर्णन केल्लेप्रमाण Gas1-GFP अभिव्यक्त करपी पेशींक (800×107) सैमीक प्रतिकारशक्ती अवक्षेपण केलें. शुध्द केल्लें Gas1-GFP SDS-PAGE वरवीं वेगळें करून पॉलीव्हिनिलिडीन फ्लोराइड (PVDF) पड्ड्यांत हस्तांतरीत केलें. पीव्हीडीएफाक ऍमायड ब्लॅक रंग दिवन प्रथिनाचें दृश्यीकरण केलें. पीव्हीडीएफांतल्यान गॅस१-जीएफपी पट्टी कापून मेथॅनॉलान ५ फावटीं आनी एक फावट द्रव वर्णपटलेखन-एमएस (एलसी-एमएस) ग्रेड उदकान धुवन काडलो. पड्ड्याची पट्टी 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर आनी 500μl ताजें विरगळिल्लें 1 M सोडियम नायट्रायट मिश्रणान 37° से. ते उपरांत पड्ड्याची पट्टी एलसी-एमएस ग्रेड उदकान चार फावटीं धुवन कोठारांतल्या तापमानांत सुकयली आनी विश्लेशणामेरेन -८० सॅ. नियंत्रण म्हणून दर एका प्रयोगाखातीर पीव्हीडीएफ पड्ड्याचो कोरो नमुनो वापरलो. उपरांत Gas1-GFP पासून काडिल्ल्या लिपिडाचें वर्णन केल्लेप्रमाण MS पद्दतीन विश्लेशण केलें (50). थोडयाच उतरांनी जीपीआय-लिपिड आशिल्लीं पीव्हीडीएफ पट्ट्यो 75μl नकारात्मक मोल्ड विरयणांत [क्लोरोफॉर्म/मेथॅनॉल (1:2) + 5 mM अमोनियम ऍसिटेट] परतून स्थलांतरीत करून इलॅक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage) पास केलें. ह्या प्रकरणांत एमएस डेटा नकारात्मक आयन मोडांत मेळयलो.
आदीं सांगिल्लेप्रमाण जीपीआय एंकराचो लिपिड भाग [3H]-इनोसिटोल-लेबल केल्ल्या जीपीआय-एपी (16) पासून वेगळो केल्लो. विरयण पद्दत (५५:४५:१० क्लोरोफॉर्म-मेथॅनॉल-०.२५% केसीएल) वापरून पातळ थराच्या वर्णपटलेखन पद्दतीन लिपिड वेगळे करून एफएलए-७००० (फुजीफिल्म) वापरून दृश्यीकरण केलें.
Gas1-GFP (600×107) अभिव्यक्त करपी पेशी TNE बफरान TNE बफरान दोन फावटीं धुवन कंवचेच्या मणींनी मोडून उपरांत केंद्रोत्सारीत करून कोशिकांचो कोळसो आनी कंवचेचे मणी काडून उडयले. उपरांत सुपरनॅटॅंट 17,000 ग्रॅम तापमानांत 4 सॅ. गोळी टीएनईंत धुवन ०.२% डिजिटलिस सॅपोनिन आशिल्ल्या टीएनईंत १ यू पीआय-पीएलसी (इन्व्हिट्रोजन) च्या आदारान ३७ सॅ. एंझायम उपचारा उपरांत 17,000 ग्रॅम 4 सॅ.तापमानाचेर 1 वरां अपक्षेपण करून पड्डो काडलो. Gas1-GFP प्रतिरक्षी अवक्षेपण करपाखातीर सुपरनॅटॅंट GFP-Trap_A (ChromoTek) कडेन 4 सॅ.तापमानाचेर रातभर उबें दवरलें. एसडीएस-पीएजीई पद्दतीन वेगळे केल्ल्या शुध्द केल्ल्या गॅस१-जीएफपीचेर कूमासी ब्रिलियंट ब्लू रंगान रंगयले. गॅस१-जीएफपी रंगोवपाचो पट्टो जलवाहिनी भोंवतणच्या राशींतल्यान कापून उडयलो आनी उपरांत आयडोएसिटामायडान आल्कायलेशन करून डायथियोथ्रायटोलान उणें केल्या उपरांत ट्रिप्सिनान जेलांत पचन केलें. जीपीआय-ग्लायकॅन आशिल्ले ट्रिप्टिक पॅप्टायड आनी पॅप्टायड काडून सुकयतात. सुकयल्लें पॅप्टायड २० μl उदकांत विरगळायलें. एलसींत एक भाग (८μl) इंजेक्शन दिवचो. विशिश्ट ग्रेडियेंट परिस्थितींत पॅप्टायड वेगळे करपाखातीर ऑक्टाडेसिलसिलेन (ODS) स्तंभ (Develosil 300ODS-HG-5; भितरलो व्यास १५० मिमी.×१.० मिमी.; नोमुरा केमिकल, आयची प्रांत, जपान) वापरलो. चल अवस्था म्हळ्यार विरयण अ (०.०८% फॉर्मिक आम्ल) आनी विरयण ब (८०% एसीटोनायट्रायलांत ०.१५% फॉर्मिक आम्ल). एक्सेला एचपीएलसी पद्दत (थर्मो फिशर सायन्टिफिक, बोस्टन, मॅसॅच्युसेट्स) वापरून स्तंभ अ विरयणान 55 मिनटांभितर 50 μl min-1 प्रवाह दरान 5 मिनटां विरगळायली आनी उपरांत विरयणाक बी ची सांद्रताय 40% मेरेन वाडयली. , अमेरिकेचीं संयुक्त संस्थानां). ईएसआय आयन स्त्रोतांत इल्युएट सतत घालून जीपीआय-ग्लायकॅन आशिल्ल्या ट्रिप्टिक पॅप्टायड आनी पॅप्टायडांचें एलटीक्यू ऑर्बिट्रॅप एक्सएल (संकरीत रेखीव आयन ट्रॅप-ऑर्बिट्राप द्रव्यमान वर्णपटमापक; थर्मो फिशर सायन्टिफिक) पद्दतीन विश्लेशण केलें. एमएस सेटअपांत केशिका स्त्रोताचो विद्युत्दाब ४.५ केव्ही असो थारायलो आनी हस्तांतरण केशिका तापमान ३०० सॅ. केशिका विद्युत्दाब आनी नळयेचो भिंग विद्युत्दाब अनुक्रमान १५ व्ही आनी ५० व्ही असो थारायलो. एमएस डेटा 300/m/z द्रव्यमान/आभार प्रमाण (m/z) 3000 ह्या द्रव्यमानाच्या आवांठांत पॉझिटिव्ह आयन मोडांत (60,000 रिझोल्यूशन; 10 भाग प्रति दशलक्ष द्रव्यमान अचूकता) मेळयलो.MS/MS डेटा LTQ Orbitrap XL [ज्या पयल्या 3 अंकांचेर डेटा आदारून आसता, टकरावाक लागून जावपी विच्छेदन) हातूंतल्या आयन सापळ्यावरवीं मेळटा (सीआयडी)].
ग्रोमैक्स (52) सॉफ्टवेअर आनी मार्टीनी 2 शक्ती क्षेत्र (53-55) वापरून एमडी अनुकरण केलें. उपरांत CHARMM GUI मेम्ब्रेन बिल्डर (56, 57) वापरून डायओलियोइलफॉस्फेटिडिलकोलीन (DOPC) आनी Cer C18 वा DOPC आनी Cer C26 हांचो आस्पाव आशिल्लो द्विस्तर तयार केलो. Cer C26 ची टोपोलॉजी आनी निर्देशांक स्फिंगोसायन शेंपडेंतल्यान अतिरिक्त मणी काडून DXCE कडल्यान मेळटात. दुप्पट थर समतोल करपाक आनी तो चालीक लावपाक सकयल वर्णीत केल्ली प्रक्रिया वापरात, मागीर Emp24 आशिल्ली प्रणाली तयार करपाक प्रणालीचे निमाणे निर्देशांक वापरात. यीस्ट Emp24 (अवशेश 173 ते 193) चें ट्रान्समेम्ब्रेन डोमेन व्हिज्युअल एमडी (VMD) साधन रेणू संरचना वापरून α-हेलिक्स म्हणून तयार केलें (58). उपरांत आडखळ आशिल्ले लिपिड काडल्या उपरांत प्रथिन खरखरीत दाणेदार करून CHARMM GUI वापरून द्विस्तरांत घालें. निमाणे पद्दतींत १२०२ डीओपीसी आनी ३०२ सेर सी२६ वा ११९७ डीओपीसी आनी २९५ सेर सी१८ आनी इम्प२४ आसतात. 0.150M सांद्रतायेमेरेन यंत्रणेचें आयनीकरण करचें. दोन द्विस्तरीय रचनांखातीर चार स्वतंत्र प्रतिकृती तयार केल्यो.
CHARMM GUI प्रक्रिया वापरून लिपिड द्विस्तर समतोल दवरतात, तातूंत 405,000 पावलां उणीं करून मागीर समतोल दवरतात, जंय स्थितीचीं मर्यादा ल्हव ल्हव उणी करून काडून उडयतात आनी वेळ पावल 0.005 ps ते 0.02 ps मेरेन वाडयतात. समतोल केल्या उपरांत तातूंतल्यान 0.02 ps च्या काळांतल्या पांवड्यान 6 μs तयार जाता. Emp24 घाल्या उपरांत, प्रणाली उणी करपाक आनी समतोल दवरपाक तीच CHARMM GUI प्रक्रिया वापरात, आनी मागीर उत्पादनांत 8 s चलयात.
सगळ्या प्रणालींखातीर समतोल प्रक्रियेंत दाबाचेर बेरेंडसन बॅरोस्टॅट (59) आनी उत्पादन प्रक्रियेंत दाब नियंत्रीत पॅरिनेलो-रहमान बॅरोस्टॅट (60) वरवीं जाता. सगळ्या प्रकरणांत सरासरी दाब १ बार आसता आनी अर्दसमरूप दाब जोडणी येवजण वापरतात. समतोल आनी उत्पादन प्रक्रियेंत अनुक्रमान प्रथिन, लिपिड आनी विरयणाच्या कणांचें तापमान जोडपाखातीर गतीचें पुनर्मापन करपी थर्मोस्टॅट (61) वापरतात. पुराय ऑपरेशनाच्या काळांत लक्ष्य तापमान 310K आसता. 0.005 बफर सहिष्णुताय आशिल्ली वर्लेट येवजण वापरून जोडणी वळेरी तयार करून बिगर बंधन परस्पर क्रिया मेजतात. विक्रिया क्षेत्र आनी १.१ एनएम हें कटऑफ अंतर वापरून कूलंब पद मेजतात. व्हॅंडर वाल्स ह्या पदांत १.१ एनएम कटऑफ अंतर आशिल्ली कटऑफ येवजण वापरतात आनी संभाव्य वाहनाखातीर व्हरलेट कटऑफ येवजण वापरतात (६२).
व्हीएमडीचो उपेग करून डीओपीसी फॉस्फेट मणी वा सेरामायड एएम१ मणी आनी प्रथिन हांचेमदली कटऑफ तरंगलांबाय ०.७ एनएम आसता आनी प्रथिनाकडेन संपर्क सादपी लिपिडांची संख्या मेजतात. सकयल दिल्ल्या सूत्राप्रमाण (63) प्रमाण डिप्लीशन-समृध्दी (DE) घटक मेजचो: DE घटक = (प्रथिनांतल्या वट्ट लिपिडांचें प्रमाण 0.7) प्रथिनांतल्या 0.7 (वट्ट लिपिडांत Cer चें प्रमाण)
अहवाल दिल्लें मोल सरासरी प्रमाण मेळटा, आनी चुकीचे पट्टे एसईचीं चार स्वतंत्र प्रतीं आसात. DE घटकाचें सांख्यिकी म्हत्व t चांचणी [(सरासरीDE-घटक-1)/SE] वरवीं मेजतात. एक शेंपडी आशिल्ल्या वितरणांतल्यान पी मोल मेजचें.
ट्रेसाच्या निमाण्या 250 ns भितर Emp24 आशिल्ल्या प्रणालीचो 2D पार्श्व घनताय नकासो मेजपाखातीर GROMACS साधनाचो उपेग केलो. सेरामायडाचो समृध्दी/उणाव नकासो मेळोवपाखातीर Cer च्या घनताय नकाशाक Cer आनी DOPC हांच्या नकाशाच्या बेरीजान भाग करतात आनी उपरांत कुडींतल्या Cer च्या सांद्रतायेन भाग करतात. तेच रंग नकाशाचे प्रमाण वापरतात.
ह्या लेखा खातीर पूरक साहित्या खातीर, उपकार करून पळयात http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
हो क्रिएटिव्ह कॉमन्स एट्रिब्यूशन-बिगर वेपारी परवान्याच्या नेमा खाला वितरीत केल्लो मुक्त प्रवेश लेख आसा, जो खंयच्याय माध्यमांत वापर, वितरण आनी पुनरुत्पादन करपाक परवानगी दिता, जो मेरेन निमाणो वापर वेवसायीक फायद्या खातीर ना आनी मूळ काम बरोबर आसा असो आदार आसा. संदर्भ.
टिप: आमी तुमकां फकत तुमचो ईमेल पत्तो दिवपाक सांगतात, जाका लागून तुमी पानाचेर शिफारस करतात त्या मनशाक तुमकां ईमेल पळोवंक जाय आनी तो स्पॅम न्हय हें कळटलें. आमी खंयचेच ईमेल पत्ते कॅप्चर करचे नात.
तुमी भेटीदार आसात काय ना हाची चांचणी करपाक आनी आपोआप स्पॅम सादर करपाक आडावपाक हो प्रस्न वापरतात.
सोफिया रॉड्रिगीज-गॅलार्डो, काझुओ कुरोकावा, सुसाना साबिदो-बोझो, आलेझांड्रो कोर्टेज · गोमेझ (अलेझांड्रो कोर्टेस-गोमेझ), आत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेदा), व्हॅलेरिया झोनी (व्हॅलेरिया झोनी), ऑक्सीलियाडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, आना मारिया पेरेझ -लिनेरो), सर्जियो लोपेझ (सर्जीओ लोपेझ), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमान (मियाको रिमान), प्रो आकिरा, स्टीफनो फॅनी, अकिहिको नाकानो, मॅन्युएल मुनीझ
3D उच्च रिझोल्यूशन रियल-टायम इमेजिंगांतल्यान निवडक उत्पादन सुवातींनी प्रथिन क्रमवारी करपाखातीर सेरामायड साखळी लांबायचें म्हत्व स्पश्ट जाता.
सोफिया रॉड्रिगीज-गॅलार्डो, काझुओ कुरोकावा, सुसाना साबिदो-बोझो, आलेझांड्रो कोर्टेज · गोमेझ (अलेझांड्रो कोर्टेस-गोमेझ), आत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेदा), व्हॅलेरिया झोनी (व्हॅलेरिया झोनी), ऑक्सीलियाडोरा अगुइलेरा-रोमेरो, आना मारिया पेरेझ -लिनेरो), सर्जियो लोपेझ (सर्जीओ लोपेझ), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमान (मियाको रिमान), प्रो आकिरा, स्टीफनो फॅनी, अकिहिको नाकानो, मॅन्युएल मुनीझ
3D उच्च रिझोल्यूशन रियल-टायम इमेजिंगांतल्यान निवडक उत्पादन सुवातींनी प्रथिन क्रमवारी करपाखातीर सेरामायड साखळी लांबायचें म्हत्व स्पश्ट जाता.
©2020 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द अॅडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सगळे हक्क राखीव आसात. एएएएस हिनारी, अगोरा, ओआरे, कोरस, क्लॉकएसएस, क्रॉसरेफ आनी काउंटर हांचो भागीदार आसा. सायन्सएडव्हान्सेस आयएसएन 2375-2548.