प्रतिकारशक्ती संशोधक चयापचय पदार्थ हें अर्बुदाच्या सूक्ष्म वातावरणाचें (TME) एक मुखेल खाशेलपण आसता, पूण कांय आडवाद सोडल्यार तांची वळख चड करून अज्ञात उरल्या. हांगा आमी उच्च दर्ज्याच्या सीरस कार्सिनोमा (HGSC) आशिल्ल्या दुयेंतीच्या अर्बुदां आनी जठरांतल्यान अर्बुद आनी टी पेशींचें विश्लेशण करून ह्या वेगवेगळ्या टीएमई विभागांचो मेटाबोलोम उक्तो केलो. जठर आनी अर्बुद पेशींत चयापचयांत व्हड प्रमाणांत फरक आसता. जठराच्या तुळेंत अर्बुदांत घुसपी टी पेशींत १-मिथिलनिकोटिनामायड (MNA) खूब प्रमाणांत समृध्द जाता. टी कोशिकांतल्या एमएनएची पातळी जरी चड आसली तरी निकोटिनामायड एन-मिथिलट्रांसफॅरेज (एस-एडेनोसिलमेथिओनिनापसून निकोटिनामायडाक मिथिल गटांचें हस्तांतरण उत्प्रेरक करपी एंझायम) ची अभिव्यक्ती तंतूकण आनी अर्बुद पेशींमेरेन मर्यादीत आसता. कार्यात्मक नदरेन एमएनए टी पेशींक अर्बुद वाडोवपी सायटोकायन अर्बुद क्षय घटक आल्फा स्रावीत करपाक प्रेरीत करता. देखून टीएमई-उत्पन्न एमएनए टी पेशींच्या रोगप्रतिकार शक्त नियंत्रणांत योगदान दिता आनी मनशाच्या कॅन्सराचेर उपचार करपाखातीर संभाव्य प्रतिकारशक्तीचे लक्ष्य दाखयता.
अर्बुदापसून मेळपी चयापचयाचो अर्बुदाआड प्रतिकारशक्तीचेर खोलायेन प्रतिबंधात्मक परिणाम जावंक शकता आनी चडांत चड पुराव्यांवयल्यान ते रोगाची वाड जावपाक एक मुखेल चालक शक्त म्हणूनय काम करपाक शकतात अशें दिसून येता (1). वॉरबर्ग परिणामावांगडाच अर्बुद पेशींची चयापचयाची स्थिती आनी अर्बुदाच्या सूक्ष्मवातावरणाच्या (TME) रोगप्रतिकार स्थितीकडेन ताचो संबंद वळखुपाखातीर हालींच्या काळांत काम सुरू जालां. मुयाच्या आदर्शांचेर आनी मनशाच्या टी पेशींचेर केल्ल्या अभ्यासावयल्यान ग्लुटामाइन चयापचय (2), ऑक्सिडीभवन चयापचय (3) आनी ग्लुकोज चयापचय (4) वेगवेगळ्या रोगप्रतिकार पेशी उपसमूहांचेर स्वतंत्रपणान कार्य करपाक शकता अशें दिसून आयलां. ह्या मार्गांतले जायते चयापचय पदार्थ टी पेशींच्या अर्बुदविरोधी कार्याक आळाबंदा हाडटात. टेट्राहायड्रोबायोप्टेरिन (BH4) ह्या सहएंझायमाच्या आडखळांतल्यान टी पेशींच्या प्रसाराक लुकसाण जावंक शकता आनी कुडींत बीएच4 वाडल्यार सीडी4 आनी सीडी8 हांच्या मध्यस्थीन जावपी अर्बुदविरोधी प्रतिकारशक्तीचो प्रतिसाद वाडूंक शकता हें सिध्द जालां. तेभायर बीएच४ (५) दिल्यार किनुरेनिनाचो रोगप्रतिकार शक्त उणी करपी परिणाम सोडोवंक मेळटा. आयसोसायट्रेट डिहायड्रोजनेज (IDH) उत्परिवर्तित ग्लियोब्लास्टोमांत एनान्टीओमेटाबोलिक (R)-2-हायड्रोक्सीग्लुटारेट (R-2-HG) च्या स्रावाक लागून टी कोशिका सक्रियता, प्रसार आनी सायटोलायसिस क्रियाशीलताय आडावप जाता (6). हालींच्या काळांत ग्लायकोलायसीसाचें उपउत्पादन मिथिलग्लायॉक्सॅल मायलोइड मूळच्या सप्रेसर पेशींनी तयार जाता आनी मिथिलग्लायॉक्सॅलाचें टी कोशिका हस्तांतरण प्रभावी टी कोशिकांच्या कार्याक आडावंक शकता अशें दाखयलां. उपचारांत मिथिलग्लायोक्सॅलाचें निश्क्रीयीकरण मायलोइड-उत्पन्न सप्रेसर पेशींची (MDSC) क्रियाशीलताय पयस करूं येता आनी मुयाच्या मॉडेलांत चेकपॉइंट ब्लॉकेड उपचाराक समन्वयात्मक रितीन वाडोवंक शकता (7). ह्या अभ्यासांत सामुहीकपणान टी कोशिकांच्या कार्याचें आनी क्रियाशीलतेचें नियंत्रण करपाक टीएमई-उत्पन्न चयापचयाच्या मुखेल भुमिकेचेर भर दिला.
अंडाशयाच्या कॅन्सरांत टी पेशींची विकृतताय खूब प्रमाणांत दिसून आयल्या (8). हाका कांय प्रमाणांत हायपोक्सिया आनी असामान्य अर्बुदाच्या नाडीसंस्थेंत आशिल्ल्या चयापचयाच्या खाशेलपणांक लागून (9) जाता, जाका लागून ग्लुकोज आनी ट्रिप्टोफॅन हांचें लॅक्टिक आम्ल आनी काइनुरेनीन ह्या उपउत्पादनांत रुपांतर जाता. चड कोशिकेभायर लॅक्टेट आसल्यार इंटरफेरोन-γ (IFN-γ) चें उत्पादन उणें जाता आनी मायलोसप्रेसिव्ह उपसमूहांचें भेद करपाक चालना मेळटा (10, 11). ट्रिप्टोफॅनाचो सेवन टी कोशिकांच्या प्रसाराक थेट आळाबंदा हाडटा आनी टी कोशिका ग्राही संकेताक आळाबंदा हाडटा (12-14). हे निरिक्षण आसून लेगीत प्रतिकारशक्ती चयापचया भोंवतणीं खूब काम अनुकूल केल्ल्या माध्यमांचो उपेग करून आंगांतल्यान टी पेशी संवर्धनांत केलो, वा विव्होंतल्या समरूप मुयाच्या मॉडेलांमेरेन मर्यादीत उरलो, तातूंतल्या दोनूय प्रकारांत मनशाच्या कॅन्सराची विषमता आनी शारिरीक स्थूल आनी सूक्ष्म वातावरण हांचेमदीं पुरायपणान प्रतिबिंब दिसना.
अंडाशयाच्या कॅन्सराचें एक सामान्य खाशेलपण म्हळ्यार पेरिटोनियल पातळप आनी जठराचो प्रकार दिसप. जठरांत पेशी द्रव जमपाचो संबंद प्रगत रोग आनी वायट पूर्वानुमान हांचेकडेन आसता (15). अहवालांप्रमाण हो खाशेलो विभाग हायपोक्सिक आसता, तातूंत रगतपेशींच्या अंतःस्थल वाडीचो घटक (VEGF) आनी इंडोलिअमायन २,३-डायऑक्सिजनेज (IDO) हांची चड प्रमाणांत पातळी आसता आनी तातूंत टी नियंत्रक पेशी आनी मायलोइड प्रतिबंधक पेशी घुसतात (१५-१८). जठराचें चयापचयाचें वातावरण अर्बुदापरस वेगळें आसूं येता, देखून पेरिटोनियल जाग्यार टी पेशींचें पुनर्प्रोग्रामिंग स्पश्ट ना. तेभायर अर्बुदाच्या वातावरणांत आशिल्ल्या जठर आनी चयापचयद्रव्यांमदले मुखेल फरक आनी विषमतायेक लागून रोगप्रतिकार पेशींच्या घुसपणुकेक आनी अर्बुदाचेर तांचें कार्य आडखळ येवंक शकता आनी फुडलें संशोधन करपाची गरज आसा.
हे प्रस्न सोडोवपाखातीर आमी संवेदनशील पेशी वेगळेपण आनी द्रव वर्णपटलेखन टॅंडम मास स्पॅक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) पद्दत तयार करून वेगवेगळ्या पेशी प्रकारांचो (सीडी4 + आनी सीडी 8 + टी पेशी सयत) तशेंच अर्बुदांभितर आनी अर्बुदांमदीं अभ्यास केलो ताचे चयापचय पदार्थ एकाच जठरांत आनी दुयेंतीच्या अर्बुदाच्या वातावरणांतल्या पेशींक पातळ्ळ्यात. ह्या मुखेल लोकसंख्येच्या चयापचयाचे स्थितीचें अत्यंत निराकरण केल्लें चित्र मेळोवपाखातीर आमी ही पद्दत उच्च आयामी प्रवाह कोशिकामिती आनी एकेच कोशिकीय आरएनए क्रमांकन (scRNA-seq) हांचेवांगडा वापरतात. हे पद्दतीन अर्बुद टी पेशींतल्या १-मिथिलनिकोटिनामायड (MNA) च्या प्रमाणांत म्हत्वाची वाड जाल्ल्याचें दिसून आयलें आनी आंतकड्यांनी केल्ल्या प्रयोगांतल्यान टी कोशिकांच्या कार्याचेर एमएनएचो प्रतिकारशक्ती नियंत्रक परिणाम पयलीं खबर नाशिल्लो अशें दिसून आयलें. सादारणपणान ही पद्दत अर्बुद आनी रोगप्रतिकार पेशी हांचेमदली परस्पर चयापचयाची परस्पर क्रिया उक्ती करता आनी रोगप्रतिकार शक्त नियंत्रण चयापचयाची खाशेली म्हायती दिता, जी टी पेशी आदारीत अंडाशयाच्या कॅन्सराचेर उपचार करपाक उपेगी पडूं येता प्रतिकारशक्ती उपचार संद.
आमी उच्च-आयामी प्रवाह सायटोमेट्रीचो उपेग एकाच वेळार ग्लुकोज घेवपाचें प्रमाण थारायलें [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) आनी मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) बाजू बाजून सादारण आसात रोगप्रतिकार पेशी आनी अर्बुद पेशी लोकसंख्येंत भेद करपी निशाण (कोश्टक S2 आनी आकृती S1A). ह्या विश्लेशणावरवीं टी पेशींचे तुळेंत जठर आनी अर्बुद पेशींत ग्लुकोज घेवपाची पातळी चड आसता, पूण मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलतेंत ल्हान फरक आसता अशें दिसून आयलें. अर्बुद पेशींचें [CD45-EpCAM (EpCAM)+] सरासरी ग्लुकोज घेवप टी पेशींपरस तीन ते चार पटींनी आसता आनी सीडी 4 + टी पेशींचें सरासरी ग्लुकोज घेवप सीडी 8 + टी पेशींपरस 1.2 पटींनी आसता, जें दाखयता की अर्बुद घुसपपी लिंफोसाइट्स (TIL) हांकां एकाच टीएमईंत लेगीत चयापचयाची गरज वेगवेगळी आसता (आकृती 1A). हाचे उरफाटें अर्बुद पेशींतली मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता सीडी ४ + टी पेशींभशेन आसता आनी दोनूय प्रकारच्या पेशींची मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता सीडी ८ + टी पेशींपरस चड आसता (आकृती १ बी). सादारणपणान ह्या निकालांतल्यान चयापचयाची पातळी दिसून येता. अर्बुद पेशींची चयापचयाची क्रियाशीलता सीडी ४ + टी पेशींपरस चड आसता आनी सीडी ४ + टी पेशींची चयापचय क्रिया सीडी ८ + टी पेशींपरस चड आसता. पेशी प्रकारांतल्यान हे परिणाम जाले तरी अर्बुदांकडेन तुळा केल्यार सीडी ४ + आनी सीडी ८ + टी पेशींच्या चयापचयाचे स्थितींत वा जठरांतल्या तांच्या सापेक्ष प्रमाणांत एकसारको फरक दिसना (आकृती १ सी). हाचे उरफाटें सीडी४५-पेशींच्या अंशांत जठराच्या तुलनेत अर्बुदांतल्या EpCAM+ पेशींचें प्रमाण वाडटा (आकृती १डी). तशेंच EpCAM+ आनी EpCAM- कोशिका घटकांमदीं चयापचयाचो स्पश्ट फरक आमी पळयलो. EpCAM+ (अर्बुद) पेशींत EpCAM- पेशींपरस ग्लुकोज घेवप आनी मायटोकॉंड्रियल क्रिया चड आसता, जी TME हातूंतल्या अर्बुद पेशींतल्या तंतूकणांच्या चयापचयाच्या क्रियाशीलतेपरस खूब चड आसता (आकृती 1, E आनी F).
(A आनी B) ग्लुकोज घेवपाची मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) (2-NBDG) (A) आनी सीडी 4 + टी पेशींची मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता (MitoTracker dark red) (B) प्रतिनिधीक आलेख (दावें) आनी कोश्टकीय डेटा (उजवें), CD8 + T पेशी आनी EpCAM + CD45-अर्बुद पेशी जठर आनी अर्बुद हांचेपसून. (C) जठर आनी अर्बुदांतल्या सीडी ४ + आनी सीडी ८ + पेशींचें (सीडी३ + टी पेशींचें) प्रमाण. (D) जठर आनी अर्बुदांतल्या EpCAM + अर्बुद पेशींचें प्रमाण (CD45−). (E आनी F) EpCAM + CD45-अर्बुद आनी EpCAM-CD45-मॅट्रिक्स ग्लुकोज घेवप (2-NBDG) (E) आनी मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता (MitoTracker डार्क रेड) (F) प्रतिनिधीक आलेख (दावें) आनी कोश्टकीय डेटा ( उजवे वटेन) जठर आनी अर्बुद पेशी. (G) प्रवाह कोशिकामितीवरवीं सीडी२५, सीडी१३७ आनी पीडी१ अभिव्यक्तीचे प्रतिनिधीक आलेख. (H आनी I) सीडी4 + टी पेशींचेर (H) आनी सीडी8 + टी पेशींचेर (I) सीडी25, सीडी137 आनी पीडी1 अभिव्यक्ती. (J आनी K) CCR7 आनी CD45RO हांच्या अभिव्यक्तीचेर आदारिल्ले भोळें, केंद्रीय स्मृती (Tcm), प्रभावक (Teff) आनी प्रभावक स्मृती (Tem) फेनोटायप. जठर आनी अर्बुदांतल्या सीडी ४ + टी पेशी (जे) आनी सीडी ८ + टी पेशी (के) हांचीं प्रतिनिधीक प्रतिमा (दावें) आनी कोश्टकीय म्हायती (उजवें). जोडीदार टी-परीक्षा (*P<0.05, **P<0.01 आनी ***P<0.001) वरवीं थारायिल्लीं पी मोलां. रेखा जुळिल्ल्या दुयेंतीचें प्रतिनिधित्व करता (n = 6). एफएमओ, प्रतिदीप्ति उणे एक; एमएफआय, मध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता.
फुडल्या विश्लेशणावरवीं चड रिझोल्यूशन केल्ल्या टी कोशिकांच्या फेनोटायपीक स्थितींत हेर म्हत्वाचे फरक दिसून आयले. अर्बुदांतली सक्रिय (आकृती १, जी ते आय) आनी प्रभावक स्मृती (आकृती १, जे आनी के) जठराच्या (सीडी ३ + टी पेशींचें प्रमाण) परस खूब चड प्रमाणांत आसता. तेच प्रमाण सक्रियता निशाण (CD25 आनी CD137) आनी डिप्लीशन मार्कर [प्रोग्राम केल्लें कोशिका मरण प्रथिन 1 (PD1)] हांच्या अभिव्यक्तीवरवीं फेनोटायपाचें विश्लेशण केल्यार ह्या लोकसंख्येचीं चयापचयाचीं खाशेलपणां वेगळीं आसलीं तरी (आकृती S1, B ते E) , पूण भोळें, प्रभावक वा स्मृती उपसमुहांत सातत्यान म्हत्वाचो चयापचयाचो फरक दिसूंक ना (आकृती S1, F ते I) अशें दिसून आयलें. मशीन लर्निंग पद्दतींचो उपेग करून आपोआप पेशी फेनोटायप (21) नेमून ह्या परिणामांची खात्री जाली, जाका लागून दुयेंतीच्या जठरांत व्हड प्रमाणांत अस्थीमज्जा पेशी (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) आशिल्ल्याचें आनीक स्पश्ट जालें (आकृती S2A). वळखून घेतिल्ल्या सगळ्या पेशी प्रकारांत हे मायलोइड पेशी लोकसंख्येंत ग्लुकोज घेवप आनी मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता सगळ्यांत चड दिसून आयली (आकृती S2, B ते G). ह्या निकालांतल्यान एचजीएससी दुयेंतींतल्या जठरांत आनी अर्बुदांत मेळपी जायत्या पेशी प्रकारांतल्या खर चयापचयाच्या फरकांचेर भर दिला.
टीआयएलाचीं चयापचयाचीं खाशेलपणां समजून घेवपाचें मुखेल आव्हान म्हळ्यार अर्बुदापसून फावो त्या प्रमाणांत शुध्दताय, दर्ज्याचे आनी प्रमाणाचे टी पेशीचे नमुने वेगळे करपाची गरज. प्रवाह कोशिकामितीचेर आदारिल्ल्या क्रमवारी आनी मणी समृध्दी पद्दतींक लागून कोशिकीय चयापचयाच्या स्वरूपांत बदल जावंक शकतात अशें हालींच्या अभ्यासांतल्यान दिसून आयलां (22-24). ही समस्या पयस करपाखातीर आमी एलसी-एमएस/एमएस वरवीं विश्लेशण करचे पयलीं शस्त्रक्रिया करून काडिल्ल्या मनशाच्या अंडाशयाच्या कॅन्सरापसून टीआयएल वेगळो करपाखातीर आनी वेगळो करपाखातीर मणी समृध्दी पद्दतीचें अनुकूलन केलें (पळयात साहित्य आनी पद्दती; आकृती 2 अ). चयापचयांतल्या बदलांचेर ह्या प्रोटोकॉलाच्या एकंदर परिणामाचें मुल्यांकन करपाखातीर आमी वयल्या मणी वेगळे करपाच्या पांवड्या उपरांत भलायकेन बऱ्या दात्यांनी सक्रिय केल्ल्या टी पेशींच्या चयापचयाच्या स्वरूपाची तुळा मणी वेगळे नाशिल्ल्या पूण बर्फाचेर उरिल्ल्या पेशींकडेन केली. ह्या गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेशणांत ह्या दोन परिस्थितींमदीं चड परस्परसंबंद आशिल्ल्याचें दिसून आयलें (r = 0.77), आनी 86 चयापचयद्रव्यांचो गट तंत्रीक पुनरावृत्तीक्षमताय चड पुनरावृत्तीक्षमता आसा (आकृती 2B). देखून ह्या पद्दतींनी कोशिका प्रकार समृध्दी करपी पेशींत अचूक चयापचयाचें विश्लेशण करूं येता, अशे तरेन एचजीएससींतल्या विशिश्ट चयापचयाची वळख करपाखातीर पयलो उच्च रिझोल्यूशन प्लॅटफॉर्म मेळटा, जाका लागून लोकांक कोशिका विशिश्टतायेची खोलायेन समजूत मेळूंक शकता लैंगीक चयापचयाचो कार्यक्रम.
(अ) चुंबकीय मणी समृध्दीचें आरेखन आरेखन. एलसी-एमएस/एमएस पद्दतीन विश्लेशण करचेपयलीं पेशी सलग तीन फेऱ्यो चुंबकीय मणी समृध्दी करतले वा बर्फाचेर उरतल्यो. (ब) चयापचयद्रव्यांच्या भरपूर प्रमाणांत समृध्दी प्रकाराचो परिणाम. दर एका समृध्दी प्रकाराखातीर तीन मापांची सरासरी ± SE. राशी रेखा 1:1 संबंद दाखयता. अक्ष लेबलांत दाखयल्लो परत परत केल्ल्या मापांचो वर्गांतलो सहसंबंद (ICC). एनएडी, निकोटिनामायड एडेनिन डायन्युक्लिओटायड. (C) दुयेंतीच्या चयापचयाच्या विश्लेशणाच्या कार्यप्रवाहाचें आराखडें. जठर वा अर्बुद दुयेंतींकडल्यान एकठांय करून तांकां क्रायोप्रिझर्व्ह करतात. दर एका नमुन्याचो ल्हानसो भाग प्रवाह कोशिकामितीवरवीं विश्लेशण केलें, जाल्यार उरिल्ल्या नमुन्यांचेर सीडी ४+, सीडी ८+ आनी सीडी ४५- पेशींखातीर तीन फेरयो समृध्दी केल्यो. ह्या कोशिका अंशांचें विश्लेशण एलसी-एमएस/एमएस वापरून केलें. (D) प्रमाणीत चयापचयाच्या भरपूर प्रमाणाचो उश्णताय नकासो. डेंड्रोग्राम नमुन्यांमदल्या युक्लिडीय अंतराच्या वॉर्डाच्या चोम्यांचें प्रतिनिधित्व करता. (इ) नमुन्याच्या चयापचयाच्या नकाशाचें मुखेल घटक विश्लेशण (PCA), दर एका नमुन्याच्यो तीन प्रतिकृती दाखोवपी, एकाच दुयेंतीच्या नमुन्यांचे रेशेन जोडिल्ले आसतात. (F) दुयेंतीचेर परिस्थितीबध्द केल्ल्या नमुन्याच्या चयापचयाच्या स्वरूपाचो पीसीए (म्हळ्यार आंशिक रिडंडन्सी वापरून); नमुन्याचो प्रकार बहिर्गोल खांद्याक लागून मर्यादीत आसता. पीसी१, मुखेल घटक १; पीसी2, मुखेल घटक 2.
उपरांत आमी ही समृध्दी पद्दत वापरून स एचजीएससी दुयेंतीच्या प्राथमीक जठर आनी अर्बुदांतल्या सीडी ४ +, सीडी ८ + आनी सीडी ४५-कोशिका अंशांतल्या ९९ चयापचयाचें विश्लेशण केलें (आकृती २ सी, आकृती एस ३ ए आनी कोश्टक एस ३ आनी एस ४). जिव्या पेशीच्या मूळ व्हड नमुन्यांत रूचीची लोकसंख्या २% ते ७०% आसता आनी पेशींचें प्रमाण दुयेंतीमदीं खूब वेगवेगळें आसता. मणी वेगळे केल्या उपरांत नमुन्यांतल्या सगळ्या जिव्या पेशींत सरासरी ८५% परस चड व्याजाचो समृध्द अंश (सीडी४+, सीडी८+ वा सीडी४५-) आसता. हे समृध्दी पद्दतीन मनशाच्या अर्बुदाच्या ऊतकांच्या चयापचयांतल्यान पेशी लोकसंख्येचें विश्लेशण करपाक मेळटा, जें व्हड नमुन्यांतल्यान करप अशक्य आसा. ह्या प्रोटोकॉलाच्या आदारान आमी l-kynurenine आनी adenosine, हे दोन बरे तरेन वळखून घेतिल्ले प्रतिकारशक्ती दमन करपी चयापचय अर्बुद टी पेशींत वा अर्बुद पेशींत उंचायेचेर आशिल्ल्याचें थारायलें (आकृती S3, B आनी C). देखून हे परिणाम आमच्या पेशी वेगळेपण आनी द्रव्यमान वर्णपटमापन तंत्रगिन्यानाची निश्ठा आनी तांक दाखयता, जाका लागून दुयेंतीच्या ऊतकांत जैविक नदरेन म्हत्वाचे चयापचय मेळटात.
आमच्या विश्लेशणांत दुयेंती भितर आनी दुयेंती मदीं पेशी प्रकारांचें चयापचयाचें खर वेगळेपण दिसून आयलें (आकृती 2D आनी आकृती S4A). खासा करून हेर दुयेंतीच्या तुळेंत 70 व्या दुयेंतीक वेगवेगळीं चयापचयाचीं खाशेलपणां दिसून आयलीं (आकृती 2E आनी आकृती S4B), हाचेवयल्यान दुयेंती मदीं चयापचयाची व्हडलीशी विषमता आसूं येता अशें दिसून येता. हेर दुयेंती (१.२ ते २ लिटर; कोश्टक एस१) हांचे तुळेंत ७० दुयेंतींत एकठांय केल्ल्या जठराचें वट्ट प्रमाण (८० मिलिलीटर) उणें आशिल्लें हें लक्षांत घेवपासारकें आसा. मुखेल घटक विश्लेशणा वेळार (देखीक- आंशिक रिडंडन्सी विश्लेशणाचो उपेग करून) आंतर-रोगी विषमतायेचेर नियंत्रण दवरल्यार कोशिका प्रकारांमदीं एकसारके बदल दिसतात आनी कोशिका प्रकार आनी/वा सूक्ष्म वातावरण चयापचयाच्या स्वरूपाप्रमाण स्पश्टपणान एकठांय जातात (आकृती 2F). एकेच चयापचयाचें विश्लेशण केल्यार ह्या परिणामांचेर भर दिल्लो आनी पेशी प्रकार आनी सूक्ष्म वातावरण हांचेमदीं म्हत्वाचो फरक दिसून आयलो. सगळ्यांत चड चड फरक म्हळ्यार एमएनए, जो चड करून सीडी४५- पेशींत आनी अर्बुदांत घुसपी सीडी ४+ आनी सीडी ८+ पेशींत समृध्द आसता हें लक्षांत घेवपासारकें आसा (आकृती ३ अ). सीडी ४ + पेशींखातीर हो परिणाम चड स्पश्ट दिसता आनी सीडी ८ + पेशींतल्या एमएनएचेरूय वातावरणाचो खर परिणाम जाता अशें दिसता. पूण हें म्हत्वाचें न्हय, कारण स दुयेंतींतल्या फकत तीन दुयेंतींचें अर्बुदाच्या सीडी 8+ गूणांचें मुल्यांकन करूं येता. एमएनएवांगडाच जठर आनी अर्बुदांतल्या वेगवेगळ्या प्रकारच्या पेशींनी टीआयएलांत वायट लक्षणीय आशिल्ले हेर चयापचय पदार्थूय वेगवेगळ्या तरेन गिरेस्त आसतात (आकृती एस३ आनी एस४). देखून ह्या आकडेवारींतल्यान फुडल्या संशोधनाक प्रतिकारशक्ती नियंत्रीत चयापचयाचो एक आशादायक संच उक्तो जाता.
(अ) जठर आनी अर्बुद हांचेपसून मेळपी सीडी ४+, सीडी ८+ आनी सीडी ४५- पेशींत एमएनएचें सामान्यीकरण केल्लें प्रमाण. बॉक्स प्लॉटांत मध्यवर्ती (रेखा), आंतरचतुर्थांश श्रेणी (फ्रेम काज) आनी डेटा श्रेणी दाखयल्या, ती आंतरचतुर्थांश श्रेणीच्या (फ्रेम व्हिस्कर) 1.5 पटींनी मेरेन दाखयता. दुयेंती साहित्य आनी पद्दतींत वर्णन केल्लेप्रमाण पी मूल्य (*P<0.05 आनी **P<0.01) थारावपाखातीर दुयेंतीचें लिमा मोल वापरात. (ब) एमएनए चयापचयाचें आरेखन आरेखन (60). चयापचय: ​​एस-एडेनोसायल-1-मेथिओनिन; एसएएच, एस-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन; एनए, निकोटिनामायड आनी डी. एमएनए, १-मिथिलनिकोटिनामायड; २-पीवाय, १-मिथिल- २-पिरिडोन-५-कार्बोक्सायड; ४-पीवाय, १-मिथिल-४-पिरिडोन-५-कार्बोक्सायड; एनआर, निकोटिनामायड रायबोज; एनएमएन, निकोटिनामायड मोनोन्युक्लिओटायड. एंझायम (पाचवें): एनएनएमटी, निकोटिनामायड एन-मिथिलट्रांसफॅरेज; SIRT, सिर्टुइन हें नांव; एनएएमपीटी, निकोटिनामायड फॉस्फोरिबोसिल ट्रान्सफॅरेज; एओएक्स१, आल्डीहायड ऑक्सिडेज १; एनआरके, निकोटिनामायड रायबोसाइड काइनेझ; एनएमएनएटी, निकोटिनामायड मोनो न्यूक्लिओटायड अॅडेनिलेट ट्रान्सफॅरेज; Pnp1, प्युरीन न्यूक्लिओसाइड फॉस्फोरिलेज. (C) जठर (राख) आनी अर्बुद (तांबडो; n = 3 दुयेंती) हांच्या scRNA-seq चो t-SNE. (D) scRNA-seq वापरून वळखून घेतिल्ल्या वेगवेगळ्या कोशिक लोकसंख्येंत एनएनएमटी अभिव्यक्ती. (इ) एसके-ओव्ही-३, मनशाच्या भ्रूण मूत्रपिंड (एचईके) २९३टी, टी पेशी आनी एमएनए उपचार केल्ल्या टी पेशींत एनएनएमटी आनी एओएक्स१ हांची अभिव्यक्ती. गुठलायल्ली अभिव्यक्ती एसके-ओव्ही-३ च्या सापेक्ष दाखयल्या. एसईएम कडेन अभिव्यक्ती पद्दत दाखयल्या (n = 6 भलायकेन बरे दात). ३५ परस चड Ct मोलां अज्ञात (UD) मानतात. (F) 8mM MNA च्या उपचारान SK-OV-3, HEK293T, T पेशी आनी T कोशिकांत SLC22A1 आनी SLC22A2 हांची अभिव्यक्ती. गुठलायल्ली अभिव्यक्ती एसके-ओव्ही-३ च्या सापेक्ष दाखयल्या. एसईएम कडेन अभिव्यक्ती पद्दत दाखयल्या (n = 6 भलायकेन बरे दाते). ३५ परस चड Ct मोलां अज्ञात (UD) मानतात. (G) एमएनए वांगडा ७२ वरां उब्या केल्या उपरांत सक्रिय भलायकेन बऱ्या दात्याच्या टी पेशींनी पेशी एमएनएचें प्रमाण. एसईएम कडेन अभिव्यक्ती पद्दत दाखयल्या (n = 4 भलायकेन बरे दाते).
एस-एडेनोसायल-१-मेथिओनिन (SAM) पासून मिथिल गट निकोटिनामायड (NA) हातूंत निकोटिनामायड एन-मिथिलट्रांसफॅरेज (NNMT; आकृती ३ बी) वरवीं हस्तांतरीत करून एमएनए तयार जाता. एनएनएमटी मनशाच्या वेगवेगळ्या कॅन्सरांत चड प्रमाणांत अभिव्यक्त जाता आनी ताचो संबंद प्रसार, आक्रमण आनी मेटास्टॅसिस हांचेकडेन आसता (25-27). टीएमईंतल्या टी पेशींतल्या एमएनएचो स्रोत चड बरो समजून घेवपाखातीर आमी तीन एचजीएससी दुयेंतीच्या जठर आनी अर्बुदांतल्या पेशी प्रकारांतल्यान एनएनएमटीची अभिव्यक्तीचें लक्षणीकरण करपाखातीर scRNA-seq वापरलो (कोश्टक S5). सुमार ६,५०० पेशींचें विश्लेशण केल्यार जठर आनी अर्बुदाच्या वातावरणांत एनएनएमटी अभिव्यक्ती अनुमानीत तंतूकण आनी अर्बुद पेशी लोकसंख्येमेरेन मर्यादीत आशिल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती ३, सी आनी डी). पीटीपीआरसी (CD45 +) (आकृती 3D आनी आकृती S5A) अभिव्यक्त करपी खंयचेय लोकसंख्येंत एनएनएमटी अभिव्यक्ती स्पश्ट ना हें लक्षांत घेवपासारकें आसा, जें चयापचयाच्या वर्णपटांत मेळिल्लें एमएनए टी पेशींत घालून दिल्ल्याचें दाखयता. आल्डीहायड ऑक्सिडेज १ (AOX1) च्या अभिव्यक्तींतल्यान एमएनएचें रुपांतर १-मिथिल-२-पिरिडोन-५-कार्बोक्झामायड (२-पीवायआर) वा १-मिथिल-४-पिरिडोन-५-कार्बोक्झामायड (४- पीवायआर) हातूंत जाता; आकृती ३ ब) COL1A1 (आकृती S5A) अभिव्यक्त करपी तंतूकणांच्या लोकसंख्येमेरेनय मर्यादीत आसा, जीं एकठांय येवन टी पेशींनी परंपरीक एमएनए चयापचयाची तांक ना अशें दिसून येता. एचजीएससी दुयेंतीच्या जठरांतल्यान मेळिल्ल्या दुसऱ्या स्वतंत्र कोशिका डेटा संचांतल्यान ह्या एमएनए संबंदीत जंतूच्या अभिव्यक्ती पद्दतीची खात्री केल्ली (आकृती S5B; n = 6) (16). तेभायर एमएनए उपचार केल्ल्या भलायकेन बऱ्या दात्या टी पेशींचें परिमाणात्मक पॉलिमरेझ साखळी विक्रिया (qPCR) विश्लेशणावरवीं नियंत्रण एसके-ओव्ही-3 अंडाशयाच्या अर्बुद पेशींचे तुळेंत एनएनएमटी वा एओएक्स१ चड करून अभिव्यक्त जावंक नाशिल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती ३ई). ह्या अनपेक्षीत परिणामांक लागून तंतूकण वा अर्बुदांतल्यान टीएमईंतल्या लागसारच्या टी पेशींनी एमएनए स्रावीत जावं येता अशें दिसून येता.
उमेदवारांत विद्राव्य वाहक 22 (SLC22) कुटुंबान (SLC22A1, SLC22A2 आनी SLC22A3) संकेतित केल्ल्या कार्बनी कॅटॅशन ट्रान्सपोर्टर 1 ते 3 (OCT1, OCT2 आनी OCT3) हांचो आस्पाव आसलो तरी एमएनएचे संभाव्य वाहक अजूनय अनिर्धारीत आसात (28) . भलायकेन बऱ्या दात्याच्या टी पेशींतल्यान मेळिल्ल्या mRNA च्या क्यूपीसीआरांत SLC22A1 ची उणी अभिव्यक्ती पातळी पूण SLC22A2 ची वळखूंक मेळनाशिल्ली पातळी दिसून आयली, ताका लागून साहित्यांत ताची पयली म्हायती मेळिल्ल्याची खात्री जाली (आकृती 3F) (29). हाचे उरफाटें एसके-ओव्ही-३ अंडाशयाच्या अर्बुद पेशी रेशेंत दोनूय वाहकांची उंचेली पातळी अभिव्यक्त जाली (आकृती ३एफ).
टी पेशींनी परकी एमएनए शोशून घेवपाची तांक आसपाची शक्यताय चांचणी करपाखातीर भलायकेन बऱ्या दात्या टी पेशींची एमएनएच्या वेगवेगळ्या सांद्रतायेच्या आदारान ७२ वरां संवर्धन केलें. बाह्यजनन एमएनए नासतना एमएनएचें कोशिकीय आशय सोदून काडूंक मेळना (आकृती ३ जी). पूण बाह्यजनन एमएनए हांणी उपचार केल्ल्या सक्रिय टी पेशींनी पेशींतल्या एमएनए प्रमाणांत डोस-आदारीत वाड दिसून आयली, ती ६ मिमी.एमएनए मेरेन (आकृती ३ जी). ह्या निकालावयल्यान ट्रान्सपोर्टर अभिव्यक्तीची उणी पातळी आनी कोशिकेभितरल्या एमएनए चयापचयाक जापसालदार आशिल्ल्या मुखेल एंझायमाचो उणाव आसून लेगीत टीआयएल अजूनय एमएनए घेवंक शकता अशें दिसून येता.
दुयेंतीच्या टी पेशींतल्या चयापचयाच्या वर्णपटांतल्यान आनी आंगांतल्यान एमएनए शोशण प्रयोगांतल्यान कॅन्सराक संबंदीत आशिल्ल्या तंतूकणांतल्यान (CAF) एमएनए स्रावीत जावपाची शक्यताय वाडटा आनी अर्बुद पेशी टीआयएलच्या फेनोटायपाचें आनी कार्याचें नियंत्रण करपाक शकतात. टी पेशींचेर एमएनएचो परिणाम थारावपाखातीर एमएनएच्या उपस्थितींत वा नासतना भलायकेन बऱ्यो दात्यो टी पेशी आंगांतल्यान सक्रिय करून तांचो प्रसार आनी सायटोकायन उत्पादन हांचें मुल्यांकन केलें. चडांत चड डोसांत एमएनए घालून 7 दिसांनी लोकसंख्येची दुप्पट संख्या मातशी उणी जाली, जाल्यार सगळ्या डोसांत उर्बा तिगून उरली (आकृती 4 अ). तेभायर बाह्यजनन एमएनएचेर उपचार केल्ल्यान अर्बुद क्षय घटक-α (TNFα; आकृती 4B) अभिव्यक्त करपी सीडी 4 + आनी सीडी 8 + टी पेशींचें प्रमाण वाडलें. हाचे उरफाटें सीडी ४ + टी पेशींत आयएफएन-γ चें कोशिकेभितर उत्पादन खूब उणें जालें, पूण सीडी ८ + टी पेशींत उणें जालें आनी इंटरल्युकिन २ (आयएल-२; आकृती ४, सी आनी डी) हातूंत व्हडलोसो बदल जालो ना. देखून ह्या एमएनए-उपचार केल्ल्या टी पेशी संस्कृतायांतल्या सुपरनॅटंटांचो एंझायम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बंट अॅसे (ELISA) हातूंत TNFα हातूंत म्हत्वाची वाड, IFN-γ उणो जावप आनी IL-2 हातूंत बदल जावंक ना अशें दिसून आयलें (आकृती 4, E ते G). . IFN-γ उणें जाल्ल्यान टी पेशींची अर्बुदविरोधी क्रिया आडावपाक एमएनएची भुमिका आसूं येता अशें दिसून येता. टी पेशी-मध्यस्थीकृत सायटोटोक्सिसिटीचेर एमएनएचो परिणाम अनुकरण करपाखातीर पाचव्या प्रतिदीप्त प्रथिन (GFP) -CAR-T) पेशींवरवीं नियंत्रीत केल्लीं फोलेट रिसेप्टर α आनी CAR-T (GFP) हांकां लक्ष्य करून काइमेरी प्रतिजन रिसेप्टर टी (FRα-CAR-T) पेशी भलायकेन बऱ्या दात्याच्या परिधीय रगताच्या एकअणुकेंद्रीय पेशींनी (PBMC) तयार करतात. सीएआर-टी पेशींची एमएनएच्या आदारान २४ वरां संवर्धन केलें, आनी उपरांत फॉलेट रिसेप्टर α अभिव्यक्त करपी मनशाच्या एसके-ओव्ही-३ अंडाशयाच्या अर्बुद पेशींवांगडा १०:१ ह्या प्रभावक आनी लक्ष्य प्रमाणांत सहसंवर्धन केलें. एमएनए उपचारा वरवीं एफआरए-सीएआर-टी पेशींची मारपाची क्रिया खूब उणी जाली, जी एडेनोसायन उपचार केल्ल्या एफआरए-सीएआर-टी पेशीं सारकीच आशिल्ली (आकृती ४ एच).
(अ) 7 व्या दिसा संस्कृतायेंतल्यान थेट एकूण जिवीत कोशिका संख्या आनी लोकसंख्या दुप्पट जावप (PD) बार आलेख स भलायकेन बऱ्या दात्यांचें सरासरी + SEM दाखयता. उण्यांत उणें n = 3 स्वतंत्र प्रयोगांतल्या डेटाचें प्रतिनिधित्व करता. (B to D) सीडी३/सीडी२८ आनी आयएल-२ हांचो उपेग करून टी पेशींक तांच्या तांच्या एमएनए सांद्रतायेचेर ७ दीस सक्रिय केलें. विश्लेशणापयलीं गोल्गीस्टॉप आशिल्ल्या पीएमए/आयनोमायसीनान पेशींक ४ वरां उत्तेजीत केल्ली. टी पेशींत TNFα (B) अभिव्यक्ती. जिव्या कोशिकांतल्या TNFα अभिव्यक्तीची उदाहरण प्रतिमा (दावें) आनी कोश्टकीय डेटा (उजवें). टी पेशींत आयएफएन-γ (सी) आनी आयएल-२ (डी) अभिव्यक्ती. सायटोकायनांची अभिव्यक्ती प्रवाह सायटोमेट्री पद्दतीन मेजली. बार ग्राफ सरासरी (n = 6 भलायकेन बऱ्या दातां) + SEM दाखयता. पी मोल थारावपाखातीर व्हेरिएन्साचे एकतरफा विश्लेशण आनी परत परत केल्ले माप (*P<0.05 आनी **P<0.01) वापरात. उण्यांत उणें n = 3 स्वतंत्र प्रयोगांतल्या डेटाचें प्रतिनिधित्व करता. (ई ते जी) सीडी३/सीडी२८ आनी आयएल-२ हांचो उपेग करून टी पेशींक तांच्या तांच्या एमएनए सांद्रतायेचेर ७ दीस सक्रिय केलें. पीएमए/आयनोमायसीन उत्तेजनाच्या 4 वरां आदीं आनी उपरांत माध्यम एकठांय केलें. TNFα (E), IFN-γ (F) आनी IL-2 (G) हांची सांद्रताय एलिझा पद्दतीन मेजली. बार ग्राफ सरासरी (n = 5 भलायकेन बरे दाते) + SEM दाखयता. व्हेरिएन्साचे एकतरफा विश्लेशण आनी परत परत माप (*P<0.05) वापरून थारायिल्लें पी मोल. बिंदू रेखा सोदून काडपाची सोद मर्यादा दाखयता. (H) कोशिका विच्छेदन परीक्षण. FRα-CAR-T वा GFP-CAR-T पेशी एडेनोसायन (250μM) वा MNA (10 mM) हांणी 24 वरां समायोजीत करून वा उपचार करिनासतना सोडली (Ctrl). एसके-ओव्ही-३ पेशींची टक्केवारी मारपाची शक्यताय मेजली. वेल्च टी चांचणेवरवीं थारायिल्लें पी मोल (*P<0.5 आनी **P<0.01).
MNA-आदारीत TNFα अभिव्यक्ती नियंत्रणाची यंत्रीक समजूत मेळोवपाखातीर MNA उपचार केल्ल्या T कोशिकांच्या TNFα mRNA च्या बदलांचें मुल्यांकन केलें (आकृती 5 अ). एमएनए उपचार केल्ल्या भलायकेन बऱ्या दात्याच्या टी पेशींनी TNFα प्रतिलिपी पातळेंत दोन पटींनी वाड दिसून आयली, हाचेवयल्यान एमएनए TNFα प्रतिलिपी नियंत्रणाचेर आदारून आसा अशें दिसून येता. हे संभाव्य नियंत्रक यंत्रणेचो अभ्यास करपाखातीर TNFα नियंत्रीत करपी दोन ज्ञात प्रतिलिपी घटक म्हळ्यार सक्रिय टी कोशिका अणुकेंद्रीय घटक (NFAT) आनी विशिश्ट प्रथिन 1 (Sp1) हांचें मूल्यमापन निकटवर्ती TNFα प्रवर्तकाक MNA बंधनाक जाप दितना केलें ( 30). TNFα प्रवर्तकांत 6 वळखून घेतिल्लीं NFAT बंधनस्थानां आनी 2 Sp1 बंधनस्थानां आसतात, जीं एकाच सुवातेर आडखळून पडटात [5'cap पासून -55 बेस जोडी (bp)] (30). क्रोमॅटीन इम्युनोप्रेसिपिटेशन (ChIP) हातूंत एमएनए उपचार केल्यार Sp1 चें TNFα प्रवर्तकाकडेन बंधन तीन पटींनी वाडटा अशें दिसून आयलें. एनएफएटीचोय आस्पाव वाडलो आनी म्हत्व लागीं पावलो (आकृती ५ ब). ह्या आकडेवारीवयल्यान एमएनए Sp1 प्रतिलिपीवरवीं TNFα च्या अभिव्यक्तीचें नियंत्रण करता, आनी उण्या प्रमाणांत NFAT च्या अभिव्यक्तीचें नियंत्रण करता अशें दिसून येता.
(अ) एमएनए नासतना संवर्धित केल्ल्या टी पेशींकडेन तुळा केल्यार एमएनए उपचार केल्ल्या टी पेशींनी टीएनएफα अभिव्यक्तींतलो पटींनी बदल जाता. एसईएम कडेन अभिव्यक्ती पद्दत दाखयल्या (n = 5 भलायकेन बरे दात). उण्यांत उणें n = 3 स्वतंत्र प्रयोगांतल्या डेटाचें प्रतिनिधित्व करता. (B) NFAT आनी Sp1 उपरांत 8 mM MNA वा ताचेबगर उपचार केल्ल्या T पेशींचो TNFα प्रवर्तक (Ctrl) आनी PMA/ionomycin उत्तेजनान 4 वरां एकठांय केलो. प्रतिरक्षी अवक्षेपणाखातीर अनुक्रमान नकारात्मक आनी सकारात्मक नियंत्रण म्हणून इम्युनोग्लोबुलिन जी (IgG) आनी एच 3 हांचो उपेग केलो. ChIP च्या प्रमाणीकरणांतल्यान MNA उपचार केल्ल्या पेशींनी Sp1 आनी NFAT हांचें TNFα प्रवर्तकाकडेन बंधन नियंत्रणाच्या तुलनेत जायते पटींनी वाडटा अशें दिसून आयलें. उण्यांत उणें n = 3 स्वतंत्र प्रयोगांतल्या डेटाचें प्रतिनिधित्व करता. एका परस चड टी-चांचण्यांनी थारायिल्लें पी मोल (*** P <0.01). (C) एचजीएससीच्या जठराच्या तुलनेत टी पेशींनी (बिगर सायटोटोक्सिक) अर्बुदांत टीएनएफची अभिव्यक्ती वाडिल्ली दिसून आयली. रंग वेगवेगळ्या दुयेंतीचें प्रतिनिधित्व करतात. दाखयल्ल्या कोशिकांचे यादीक 300 मेरेन नमुने घेतल्यात आनी ओव्हरड्राइंग मर्यादीत करपाखातीर जिटर केल्यात (** Padj = 0.0076). (D) अंडाशयाच्या कॅन्सराखातीर एमएनएचें प्रस्तावीत मॉडेल. एमएनए अर्बुद पेशींत आनी टीएमईंतल्या तंतूकणांत तयार जाता आनी टी पेशींनी तो घेता. एमएनए स्प1 चें TNFα प्रवर्तकाकडेन बंधन वाडयता, जाका लागून TNFα प्रतिलिपी आनी TNFα सायटोकायन उत्पादन वाडटा. तशेंच एमएनएक लागून आयएफएन-γ उणें जाता. टी कोशिकांच्या कार्याचेर आळाबंदा हाडल्यार मारपाची तांक उणी जाता आनी अर्बुदाची वाड बेगीन जाता.
अहवालांप्रमाण TNFα हातूंत फुडले आनी फाटीचेर आदारीत अर्बुदविरोधी आनी अर्बुदविरोधी परिणाम आसतात, पूण अंडाशयाच्या कॅन्सराची वाड आनी मेटास्टॅसिस वाडोवपाक ताची नामनेची भुमिका आसता (31-33). अहवालाप्रमाण अंडाशयाच्या कॅन्सराच्या दुयेंतीच्या जठर आनी अर्बुदाच्या ऊतकांत TNFα ची सांद्रताय सौम्य ऊतकांतल्यान चड आसता (34-36). यंत्रणेचे नदरेन TNFα धव्या रगतपेशींचें सक्रियता, कार्य आनी प्रसार नियंत्रीत करूंक शकता आनी कॅन्सर पेशींच्या फेनोटायपांत बदल करूंक शकता (37, 38). ह्या सोदांकडेन जुळपी विभेदक जीन अभिव्यक्ती विश्लेशणावरवीं जठराच्या तुलनेत अर्बुदाच्या ऊतकांतल्या टी पेशींनी टीएनएफ म्हत्वाचें प्रमाणांत अप-रेग्युलेट जाल्ल्याचें दिसून आयलें (आकृती ५ सी). TNF अभिव्यक्तींत वाड फकत बिगर सायटोटोक्सिक फेनोटायप आशिल्ल्या टी पेशी लोकसंख्येंत दिसून आयली (आकृती S5A). सारांशांत सांगपाचें जाल्यार एचजीएससींत एमएनएचे दोट्टी प्रतिकारशक्ती दमनकारी आनी अर्बुद वाडोवपी परिणाम आसात अशें मत हो डेटा आदार दिता.
प्रवाह कोशिकामितीचेर आदारिल्लें प्रतिदीप्त लेबलिंग ही टीआयएल चयापचयाचो अभ्यास करपाची मुखेल पद्दत जाल्या. ह्या अभ्यासांतल्यान अशें दिसून आयलां की परिधीय रगताच्या लिंफोसाइट्स वा दुय्यम लसीका अवयवांतल्या टी पेशींचे तुळेंत मुय आनी मनशाच्या टीआयएलांत ग्लुकोज घेवपाची चड प्रवृत्ती आसता (4, 39) आनी मायटोकॉंड्रियल कार्य ल्हव ल्हव उणें जाता (19, 40). ह्या अभ्यासांत आमी जरी अशेच परिणाम पळयल्यात तरी एकाच रिसेक्टेड अर्बुदाच्या ऊतकांतल्यान अर्बुद पेशी आनी टीआयएल हांच्या चयापचयाची तुळा करप ही मुखेल उदरगत. ह्या आदल्या कांय अहवालांकडेन जुळपी जठर आनी अर्बुदांतल्यान मेळपी अर्बुद (CD45-EpCAM +) पेशींत सीडी 8 + आनी सीडी 4 + टी पेशींपरस ग्लुकोज घेवप चड आसता, ताका लागून अर्बुद पेशींतल्या चड ग्लुकोज घेवपाची तुळा टी पेशींकडेन करूं येता अशें मानतात. टी कोशिका सर्तीची संकल्पना. टीएमई हें नांव. पूण अर्बुद पेशींची मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता सीडी ८ + टी पेशींपरस चड आसता, पूण मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता सीडी ४ + टी पेशींभशेन आसता. हे परिणाम ऑक्सिडीभवन चयापचय अर्बुद पेशींखातीर म्हत्वाचें असो उदयाक येवपी विशय बळगें दितात (41, 42). तशेंच सीडी 8 + टी पेशी सीडी 4 + टी पेशींपरस ऑक्सिडीभवन विकृततायेक चड संवेदनशील आसूं येतात वा सीडी 4 + टी पेशी मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता सांबाळपाखातीर ग्लुकोजाभायर हेर कार्बन स्त्रोतांचो उपेग करूं येतात अशें तांणी सुचयलां (43, 44). जठरांतल्या सीडी ४ + टी प्रभावक, टी प्रभावक स्मृती आनी टी केंद्रीय स्मृती पेशींमदीं ग्लुकोज घेवपांत वा मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलतेंत आमी फरक दिसूंक ना हें लक्षांत घेवचें पडटलें. तेच प्रमाण अर्बुदांतल्या सीडी ८ + टी पेशींच्या भेदक स्थितीचो ग्लुकोज घेवपाच्या बदलाकडेन कांयच संबंद नासता, ताका लागून आंगांतल्यान संवर्धित केल्ल्या टी पेशी आनी विव्हो हातूंत मनशाच्या टीआयएल हांचेमदलो म्हत्वाचो फरक स्पश्ट जाता (22). ह्या निरिक्षणांची खात्री निपक्षपाती स्वयंचलीत पेशी लोकसंख्येच्या वाटपाच्या वापरानय जाली, तातूंतल्यान फुडें स्पश्ट जालें की अर्बुद पेशींपरस चड ग्लुकोज घेवप आनी मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलता आशिल्लीं सीडी४५ + / सीडी३- / सीडी४ + / सीडी४५आरओ + पेशी प्रचलीत आसतात पूण तातूंत चयापचय सक्रिय पेशी लोकसंख्या आसता. ही लोकसंख्या scRNA-seq विश्लेशणांत वळखून घेतिल्ल्या मायलोइड सप्रेसर पेशी वा प्लाझ्मासायटोइड डेंड्रिटिक पेशी हांच्या अनुमानीत उपलोकसंख्येचें प्रतिनिधित्व करूंक शकता. जरी हीं दोनूय मनशाच्या अंडाशयाच्या अर्बुदांत नोंद जाल्यांत [45], तरी तांकां अजूनय गरज आसा फुडलो काम म्हळ्यार ह्या मायलोइड उपलोकसंख्येचें वर्णन करप.
प्रवाह कोशिकामितीचेर आदारिल्ल्या पद्दतींनी कोशिका प्रकारांतल्या ग्लुकोज आनी ऑक्सिडीभवन चयापचयांतले सामान्य फरक स्पश्ट करूं येतात तरी टीएमईंतल्या मायटोकॉंड्रियल चयापचयाखातीर ग्लुकोज वा हेर कार्बन स्त्रोतांवरवीं तयार जावपी नेमके चयापचय पदार्थ अजून थारावंक नात. दिल्ल्या टीआयएल उपसमुहांत चयापचय पदार्थांची उपस्थिती वा नासप नेमपाखातीर काडिल्ल्या ऊतकांतल्यान पेशी लोकसंख्येचें शुध्दीकरण करचें पडटा. देखून आमची पेशी समृध्दी पद्दत द्रव्यमान वर्णपटमापनासयत जोडून टी पेशींत आनी जुळपी दुयेंती नमुन्यांतल्या अर्बुद पेशी लोकसंख्येंत वेगवेगळ्या तरेन समृध्द जावपी चयापचयाची म्हायती दिवंक शकता. प्रतिदीप्ति सक्रिय केल्ल्या कोशिका क्रमवारीपरस हे पद्दतीचे फायदे आसले तरी कांय चयापचयाच्या ग्रंथालयांचेर अंतर्निहित स्थिरताय आनी/वा नेटान उलाढालीच्या दराक लागून परिणाम जावं येता (22). तरी लेगीत आमचे पद्दतीन एडेनोसायन आनी काइनुरेनीन अशे दोन वळखून घेतिल्ले प्रतिकारशक्ती दमन करपी चयापचय पदार्थ वळखुपाक येस मेळ्ळे, कारण नमुन्याच्या प्रकारांत तांचें खूब फरक आसता.
अर्बुद आनी टीआयएल उपप्रकारांचें आमचें चयापचयात्मक विश्लेशण अंडाशयाच्या टीएमईंतल्या चयापचयाच्या भुमिकेविशीं चड म्हायती दिता. पयलीं फ्लो सायटोमेट्रीचो उपेग करून आमी अर्बुद आनी सीडी ४ + टी पेशी हांचेमदीं मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलतेंत फरक ना अशें थारायलें. पूण एलसी-एमएस/एमएस विश्लेशणावरवीं ह्या लोकसंख्येंतल्या चयापचयाच्या भरपूर प्रमाणांत म्हत्वाचे बदल दिसून आयले, ताका लागून टीआयएल चयापचय आनी ताच्या एकंदर चयापचयाच्या क्रियाशीलतेविशीं निश्कर्श काडपाक बारीकसाणेन अर्थ लावपाची गरज आसा अशें दिसून आयलें. दुसरें, एमएनए हें चयापचयद्रव्य आसून तातूंत जठरांतल्या सीडी ४५-पेशी आनी टी पेशींत सगळ्यांत चड फरक आसता, अर्बुदांत न्हय. देखून विभागणी आनी अर्बुदाचें स्थान हांचो टीआयएल चयापचयाचेर वेगवेगळो परिणाम जावं येता, जाका लागून दिल्ल्या सूक्ष्म वातावरणांतल्या संभाव्य विषमतेचेर भर दिला. तिसरें, एनएनएमटी ह्या एमएनए तयार करपी एंझायमाची अभिव्यक्ती मुखेलपणान सीएएफ मेरेन मर्यादीत आसता, जी उण्या प्रमाणांत अर्बुद पेशी आसतात, पूण अर्बुदापसून मेळपी टी पेशींत सोदून काडपाक येवपी एमएनए पातळी दिसून येता. अंडाशयाच्या सीएएफांत एनएनएमटीची चड प्रमाणांत अभिव्यक्ती जाल्ल्यान कॅन्सराक चालना दिवपी परिणाम वळखूंक मेळटा, ताका कांय प्रमाणांत सीएएफ चयापचय, अर्बुदाच्या आक्रमणाक आनी मेटास्टॅसिसाच्या प्रसाराक लागून जाता (27). टीआयएलाची एकंदर पातळी जरी मध्यम आसली तरी सीएएफांतल्या एनएनएमटीची अभिव्यक्ती कॅन्सर जीनोम अॅटलास (टीसीजीए) मेसेंकिमल उपप्रकाराक लागींचो संबंद आसता, जाचो संबंद वायट अदमासाकडेन आसता (27, 46, 47). निमाणें एमएनएच्या विघटनाक जापसालदार आशिल्ल्या एओएक्स१ एंझायमाचीय अभिव्यक्ती सीएएफ लोकसंख्येमेरेन मर्यादीत आसता, हाचेवयल्यान टी पेशींनी एमएनए चयापचय करपाची तांक ना अशें दिसून येता. ह्या सोदाक लागून हो सोद सत्यापीत करपाखातीर आनीक वावर करपाची गरज आसली तरी टी पेशींत एमएनएची चड प्रमाणांत आसल्यार प्रतिकारशक्ती दमन करपी सीएएफ सूक्ष्मवातावरण आशिल्ल्याचें दाखोवंक शकता अशी कल्पना ह्या निकालांक आदार मेळटा.
एमएनए वाहकांची उणी अभिव्यक्ती पातळी आनी एमएनए चयापचयांत आस्पाव आशिल्ल्या मुखेल प्रथिनांची वळखूंक मेळनाशिल्ली पातळी पळयल्यार टी पेशींत एमएनएची उपस्थिती अप्रत्याशित आसता. दोन स्वतंत्र गटांच्या scRNA-seq विश्लेशण आनी लक्ष्य केल्ल्या qPCR वरवीं एनएनएमटी वा एओएक्स1 हांचो सोद घेवंक मेळ्ळो ना. ह्या निकालांक लागून एमएनए टी पेशींनी संश्लेशित जायना, पूण भोंवतणच्या टीएमईंतल्यान शोशून घेता अशें दिसून येता. टी पेशींत बाह्यजनन एमएनए एकठांय करपाची प्रवृत्ती आशिल्ल्याचें आंगांतल्यान प्रयोगांतल्यान दिसून येता.
आमच्या आंगांतल्यान केल्ल्या अभ्यासांतल्यान बाह्यजनन एमएनए टी पेशींत TNFα ची अभिव्यक्ती प्रेरीत करता आनी Sp1 चें TNFα प्रवर्तकाकडेन बंधन वाडयता अशें दिसून आयलां. TNFα हातूंत अर्बुदविरोधी आनी अर्बुदविरोधी अशीं दोनूय कार्यां आसलीं तरी अंडाशयाच्या कॅन्सरांत TNFα अंडाशयाच्या कॅन्सराची वाड करपाक मदत करूंक शकता (31-33). अंडाशयाच्या अर्बुद पेशी संस्कृतायेंत TNFα चें निश्क्रीयीकरण वा मुयाच्या मॉडेलांत TNFα संकेत काडून उडोवप TNFα-मध्यस्थीकृत दाहक सायटोकायन उत्पादनांत सुदारणा करूं येता आनी अर्बुदाची वाड आडावंक शकता (32, 35). देखून ह्या प्रकरणांत टीएमई-उत्पन्न एमएनए ऑटोक्राइन लूपांतल्यान टीएनएफα-आदारीत यंत्रणेवरवीं दाहक चयापचयाचो आदार म्हूण काम करूंक शकता, जाका लागून अंडाशयाच्या कॅन्सराची घडणूक आनी प्रसार जावपाक मदत जाता (31). हे शक्यतायेचेर आदारून अंडाशयाच्या कॅन्सराचेर संभाव्य उपचारात्मक घटक म्हणून TNFα आडावपाचो अभ्यास सुरू आसा (37, 48, 49). तेभायर एमएनए अंडाशयाच्या अर्बुद पेशींक सीएआर-टी पेशींची सायटोटोक्सिसिटीस इबाडटा, जाका लागून एमएनए-मध्यस्थीकृत रोगप्रतिकार शक्त दमनाचे आनीक पुरावे मेळटात. एकठांय हाडल्यार हे परिणाम एक मॉडेल सुचयतात, जातूंत अर्बुद आनी सीएएफ पेशी कोशिकेभायर आशिल्ल्या टीएमईंत एमएनए स्रावीत करतात. (i) TNF-प्रेरित अंडाशयाच्या कॅन्सराची वाड उत्तेजन आनी (ii) MNA-प्रेरित T cell cytotoxic activity inhibition वरवीं हाचो दोट्टी अर्बुद परिणाम जावं येता (आकृती 5D).
निमाणें, रॅपिड सेल्स समृध्दी, एकेच पेशी क्रमांकन आनी चयापचयाचें प्रोफायलिंग हांचो मेळ वापरून ह्या अभ्यासांत एचजीएससी दुयेंतींतल्या अर्बुद आनी जठर पेशी हांचेमदले व्हड प्रतिरक्षी चयापचयाचे फरक उक्ते जाले. ह्या व्यापक विश्लेशणावरवीं टी पेशींमदीं ग्लुकोज घेवपांत आनी मायटोकॉंड्रियल क्रियाशीलतेंत फरक आशिल्ल्याचें दिसून आयलें आनी एमएनए हें बिगर कोशिका स्वायत्त प्रतिकारशक्ती नियंत्रक चयापचयाचें म्हूण वळखलें. ह्या डेटाचो परिणाम मनशाच्या कॅन्सरांतल्या टी सेल्स चयापचयाचेर टीएमई कसो परिणाम करता हाचेर जाता. टी पेशी आनी कॅन्सर पेशी हांचेमदीं पोशक तत्वांखातीर थेट सर्त जाल्ल्याचें सांगलां तरी चयापचय पदार्थ अप्रत्यक्ष नियंत्रक म्हणूनय काम करून अर्बुदाची वाड करपाक आनी घडये अंतर्निहित रोगप्रतिकार शक्त दामपाक शकतात. ह्या नियंत्रक चयापचयाच्या कार्यात्मक भुमिकेचें फुडलें वर्णन केल्यार अर्बुदविरोधी रोगप्रतिकार शक्त वाडोवपाखातीर पर्यायी रणनिती उक्त्यो जावंक शकतात.
कॅनडियन टिश्यू रिपॉझिटरी नेटवर्कान प्रमाणीत केल्ल्या बीसी कॅन्सर अर्बुद ऊतक भंडारा वरवीं दुयेंतीचे नमुने आनी क्लिनीकल डेटा मेळयलो. बीसी कॅन्सर संशोधन नीती समिती आनी ब्रिटीश कोलंबिया विद्यापिठान मान्य केल्ल्या प्रोटोकॉल प्रमाण (H07-00463) सगळ्या दुयेंतीच्या नमुने आनी क्लिनीकल डेटा मेळयल्ल्यान माहितीपूर्ण बरयल्ली संमती मेळयली वा तांची संमती औपचारीकपणान माफ केली. नमुने प्रमाणीत बायोबँक (बीआरसी-00290) हातूंत सांठोवन दवरतात. दुयेंतींचीं सविस्तर खाशेलपणां कोश्टक S1 आनी S5 त दाखयल्यात. क्रायोप्रिझर्व्हेशन खातीर स्कॅल्पेलाचो उपेग करून दुयेंतीच्या अर्बुदाचो नमुनो यंत्रीक रितीन विघटन करतात आनी उपरांत ताका १०० मायक्रोन फिल्टरांतल्यान धुकळून एकूच पेशी निलंबन मेळटा. दुयेंतीच्या जठराची 1500 आरपीएम 4 सॅ.तापमानाचेर 10 मिनटां केंद्रोत्सारीत करून पेशी गुळयो घालून ताचेर आशिल्लें उदक काडून उडयलें. अर्बुद आनी जठरांतल्यान मेळिल्लीं पेशी ५०% उश्णतायेन निश्क्रीय केल्ल्या मनशाच्या एबी सीरम (सिग्मा-आल्ड्रिच), ४०% आरपीएमआय-१६४० (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) आनी १०% डायमिथिल सल्फोक्सायडांत क्रायोप्रिझर्व्ह केल्लीं. हे सांबाळून दवरिल्ले एकेच कोशिकीय निलंबन वितळून सकयल वर्णीत केल्ल्या चयापचयशास्त्र आनी चयापचयाचें निश्र्चितीकरण करपाखातीर वापरले.
पुराय माध्यमांत ०.२२ मायक्रोन गाळिल्लें ५०:५० पूरक आरपीएमआय १६४०: एइमव्ही आसता. आरपीएमआय १६४० + २.०५ मिमी.एल-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) हें १०% उश्णतायेन निश्क्रीय मनशाच्या एबी सीरम (सिग्मा-आल्ड्रिच), १२.५ मिमी.हेपेस (थर्मो फिशर सायन्टिफिक), २ मिमी.एल-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) फिशर सायन्टिफिक), १ x पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमायसीन (PenStrep) द्रावण (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) आनी ५० μMB-मर्कॅप्टोइथेनॉल. AimV (Invitrogen) हें २० मिमी.हेपेस (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) आनी २ मिमी.एल-ग्लुटामाइन (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) हांचे पूरक आसता. प्रवाह सायटोमीटर रंगीत बफरांत ०.२२μm गाळिल्लें फॉस्फेट बफर केल्लें खारें (PBS; Invitrogen) आसून तातूंत ३% उश्णतायेन निश्क्रीय केल्लें एबी मनीस रगत (Sigma) पुरवण केल्लें आसतालें. कोशिका समृध्दी बफर ०.२२ मायक्रोन गाळिल्ल्या पीबीएस पासून तयार जाता आनी तातूंत ०.५% उश्णतायेन निश्क्रीय केल्ल्या मनशाच्या एबी सीरम (सिग्मा-आल्ड्रिच) च्या पूरक आसता.
३७ सॅ.तापमानाच्या पुराय माध्यमांत पेशींक १० एनएम एमटी डीआर आनी १०० मायक्रोमोल २-एनबीडीजी हांणी ३० मिनटां रंगयले. उपरांत पेशींक व्हायबिलिटी डाय eF506 हें 4 सॅ.तापमानाचेर 15 मिनटां रंगयलें. एफसी ब्लॉक (ईबायोसायन्स) आनी ब्रिलियंट स्टेन बफर (बीडी बायोसायन्सेस) हातूंत पेशी परतून स्थलांतरीत करून, फ्लो सायटोमीटर रंगीत बफरांत पातळ करून (निर्मात्याच्या सुचोवण्यांप्रमाण) आनी कोठारांतल्या तापमानांत १० मिनटां उब्यो दवरच्यो. प्रवाह सायटोमेट्री रंगीत बफरांत 4 सॅ.तापमानाचेर 20 मिनटां प्रतिपिंडांच्या संचांतल्यान (कोश्टक S2) पेशींक रंगोवप. विश्लेशणा पयलीं प्रवाह कोशिकामिती रंगीत बफरांत (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R संरचना) पेशी परतून स्थलांतरीत करतात. सेल काउंट डेटाचें विश्लेशण करपाक SpectroFlo आनी FlowJo V10 वापरात, आनी डेटा तयार करपाक GraphPad Prism 8 वापरात. 2-एनबीडीजी आनी एमटी डीआर हांची मध्यवर्ती प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) लॉग-सामान्य केल्ली आनी उपरांत जुळपी दुयेंतींची हिशोब दिवपाखातीर सांख्यिकी विश्लेशणाखातीर जोडीदार टी चांचणी वापरली. 40 परस उणी घडणुको आशिल्लीं सगळीं लोकसंख्या विश्लेशणांतल्यान काडून उडोवप; सांख्यिकी विश्लेशण आनी डेटा व्हिज्युअलायझेशन करचे पयलीं खंयच्याय नकारात्मक मोला खातीर 1 चें MFI मोल दाखयात.
वयल्या प्रक्रिया पॅनलाच्या हाताळणी गेटींग रणनितीक पूरक करपाखातीर, आमी FlowJo त मेल्लीं कोशिका काडून उडयल्या उपरांत आपोआप लोकसंख्येक कोशिका नेमपाखातीर आकार निर्बंध झाडान (FAUST) (21) पुराय टिपणी वापरली. चुकीचें वाटप जाल्लें दिसपी लोकसंख्या (PD1+ आनी PD1-अर्बुद पेशी एकठांय करप) आनी तिगोवन दवरिल्ली लोकसंख्या विलीन करपाखातीर आमी हाताळणीन उत्पादन वेवस्थापन करतात. दर एका नमुन्यांत सरासरी २% परस चड पेशी आसतात, वट्ट ११ लोकसंख्येखातीर.
ल्युकोसायट वेगळे करपाच्या उत्पादनांतल्यान पीबीएमसी वेगळो करपाखातीर फिकोल ग्रेडियेंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूजेशन वापरलें (STEMCELL Technologies). सीडी ८ मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरून पीबीएमसींतल्यान सीडी ८ + टी पेशी वेगळीं करून निर्मात्याच्या सुचोवण्यांप्रमाण ट्रान्सऍक्ट (मिल्टेनी) वापरून 2 सप्तकां पुराय माध्यमांत विस्तारली. पेशींक आयएल-७ (१० एनजी/मिली; पेप्रोटेक) आशिल्ल्या पुराय माध्यमांत ५ दीस उब्यो दवरल्यो आनी उपरांत ट्रान्सऍक्टान परतून उत्तेजन दिले. सातव्या दिसा निर्मात्याच्या सुचोवण्यांप्रमाण मनशाच्या सीडी४५ मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) चो उपेग करून सलग तीन फेऱ्यांनी पेशी समृध्द केली. प्रवाह कोशिकामिती विश्लेशणाखातीर (वयर वर्णन केल्लेप्रमाण) पेशींची विभागणी केल्ली आनी एलसी-एमएस/एमएस विश्लेशणाखातीर दशलक्ष पेशी तीन फावटीं विभागणी केल्ली. नमुन्यांचेर सकयल वर्णन केल्लेप्रमाण एलसी-एमएस/एमएस पद्दतीन प्रक्रिया केल्ली. आमी 1,000 आयन संख्या आशिल्ल्या गळून पडपी चयापचयाचें मोल अदमास केलें. दर एका नमुन्याचें एकूण आयन संख्या (TIC) प्रमाण सामान्यीकरण करतात, लघुगणकीय रितीन रुपांतरीत करतात आनी विश्लेशणा पयलीं MetaboAnalystR हातूंत आपोआप सामान्य करतात.
दर एका दुयेंतीचें एकेच पेशीचें निलंबन वितळोवन 40 μm गाळणींतल्यान पुराय माध्यमांत गाळून (वयर वर्णन केल्ले प्रमाण). निर्मात्याच्या नेमाप्रमाण सीडी ८+, सीडी ४+ आनी सीडी ४५- पेशींखातीर (बर्फाचेर) नमुने समृध्द करपाखातीर मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरून चुंबकीय मणी वेगळे करून सलग तीन फेऱ्यो सकारात्मक निवड केल्यो. थोडयाच उतरांनी पेशी कोशिका समृध्दी बफरांत (वयर वर्णन केल्लेप्रमाण) परतून स्थलांतरीत करून मेजतात. पेशी मनशाच्या सीडी ८ मणी, मनशाच्या सीडी ४ मणी वा मनशाच्या सीडी ४५ मणी (मिल्टेनी) च्या आदारान ४ सॅ.तापमानाचेर १५ मिनटां उब्यो दवरल्यो आनी उपरांत पेशी समृध्दी बफरान धुवन काडल्यो. नमुनो एलएस स्तंभांतल्यान (मिल्टेनी) वतात, आनी सकारात्मक आनी नकारात्मक अपूर्णांक एकठांय करतात. काळ उणो करपाखातीर आनी कोशिका पुनर्प्राप्तीचें पावल चडांत चड करपाखातीर उपरांत सीडी ८-अंशाचो उपेग सीडी ४+ समृध्दीच्या दुसऱ्या फेरयेखातीर करतात आनी उपरांतच्या सीडी ४५-समृध्दीखातीर सीडी ४-अंशाचो उपेग करतात. वेगळे करपाचे पुराय प्रक्रियेंत हें द्रावण बर्फाचेर दवरचें.
चयापचयाच्या विश्लेशणाखातीर नमुने तयार करपाखातीर पेशी बर्फासारको थंड मीठ विरयान एकदां धुवन दर एका नमुन्यांत १ मिलिलीटर ८०% मेथॅनॉल घालून उपरांत भंवर करून द्रव नायट्रोजनांत स्नॅप गोठयले. नमुन्यांचेर तीन गोठण-वितळप चक्र करून 14,000 आरपीएम वेगान 15 मिनटां 4 सॅ. चयापचयद्रव्य आशिल्लें सुपरनॅटॅंट सुकमेरेन बाश्पीभवन करतात. चयापचयद्रव्यां ०.०३% फॉर्मिक आम्लांत ५० μl परतून विरगळून भंवर घालून भरसून उपरांत केंद्रोत्सारीत करून कोळसो काडून उडयलो.
वयर सांगिल्लेप्रमाण चयापचय पदार्थ काडप. चयापचयशास्त्र संशोधन करपाखातीर सुपरनॅटॅंट उच्च कार्यक्षमताय आशिल्ल्या द्रव वर्णपटलेखन बाटलेंत हस्तांतरीत करचें. बॅच परिणाम आडावपाखातीर दर एका नमुन्याचेर सारकेच संख्येन पेशी उपचार करपाखातीर यादीक उपचार प्रोटोकॉल वापरात. आमी AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ह्या उपकरणाचेर आदीं उजवाडाक आयिल्ल्या जागतीक चयापचयाचें गुणात्मक मुल्यांकन केलें. मल्टीक्वांट आवृत्ती 2.1 सॉफ्टवेअर (अप्लायड बायोसिस्टम्स एससीआयईएक्स) वापरून वर्णपटलेखन विश्लेशण आनी शिखर क्षेत्र एकीकरण केलें.
गळून पडपी चयापचयाचें मोल अदमास करपाखातीर 1000 आयनगणनेचो उपेग केलो आनी दर एका नमुन्याच्या टीआयसीचो उपेग करून दर एका सोदून काडिल्ल्या चयापचयाचो सामान्यीकृत शिखर क्षेत्रफळ मेजून नमुन्याच्या प्रक्रियांतल्यान साधनात्मक विश्लेशणावरवीं जावपी बदल दुरुस्त करपाखातीर केलो. TIC सामान्य केल्या उपरांत लघुगणकीय रुपांतर आनी स्वयंचलीत प्रमाण रेखा मापन करपाखातीर MetaboAnalystR(51) (मुळावी मापदंड) वापरतात. नमुन्याच्या प्रकारां मदल्या मेटाबोलोम फरकांचे संशोधनात्मक विश्लेशण करपाक आमी वेगन आर पॅकेजी वांगडा पीसीए वापरले, आनी दुयेंतीचें विश्लेशण करपाक आंशिक रिडंडन्सी विश्लेशण वापरलें. नमुन्यांमदल्या युक्लिडीय अंतराचे चोम्यांनी उश्णताय नकासो डेंड्रोग्राम तयार करपाखातीर वॉर्ड पद्दत वापरात. आमी प्रमाणीत चयापचयाच्या भरपूर प्रमाणाचेर लिमा (52) वापरून पुराय कोशिका प्रकारांत आनी सूक्ष्म वातावरणांत वेगवेगळ्या प्रमाणांत भरपूर प्रमाणांत आशिल्ले चयापचय पदार्थ वळखुले. स्पश्टीकरण सोंपें करपाखातीर आमी मॉडेल स्पश्ट करपाखातीर गट सरासरी मापदंड वापरतात, आनी सूक्ष्म वातावरणांतल्या कोशिका प्रकारांक दरेक गट (n = 6 गट) मानतात; म्हत्व चांचणेखातीर आमी दर एका चयापचयाखातीर तीन परत परत माप केलें खोटी प्रतिकृती टाळपाखातीर दुयेंतीक लिमा डिझायनांत आडखळ म्हणून आस्पाव केलो. वेगवेगळ्या दुयेंती मदल्या चयापचयाचो फरक तपासपा खातीर आमी दुयेंती सयत लिमा मॉडेल थारावीक रितीन समायोजीत केलें. आमी Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction) ह्या कोशिका प्रकार आनी सूक्ष्म वातावरण हांचेमदल्या पूर्वनिर्धारीत विपरीततायेचें म्हत्व सांगतात.
मिल्टनी डेड सेल रिमूव्हल किट (>८०% जिवीतक्षमता) वापरून उर्बेभरीत समृध्दीकरण केल्या उपरांत १०x ५′जीन अभिव्यक्ती प्रोटोकॉल वापरून एकूण जिव्या गोठयल्ल्या जठर आनी अर्बुदाच्या नमुन्यांचेर एकेच पेशीचें ट्रान्सक्रिटॉम क्रमांकन केलें. जुळपी अर्बुद आनी जठर आशिल्ल्या पांच केशींचें विश्लेशण केलें, जरी एका अर्बुदाच्या नमुन्यांतल्यान उण्या प्रमाणांत जिवीत उरपाक लागून ताचो आस्पाव जावंक नाशिल्लो. दुयेंतींच्यो जायत्यो निवडी मेळोवपाखातीर आमी 10x क्रोमियम नियंत्रकाच्या लेनांतल्या दर एका दुयेंतीचे नमुने एकठांय केले, आनी जठर आनी अर्बुदाच्या सुवातींचें वेगवेगळे विश्लेशण केलें. क्रमांकन केल्या उपरांत [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp जोडीदार शेवट (PE), क्युबेक जीनोम; सरासरी अर्बुद आनी जठराखातीर दर कोशिकेक सरासरी 73,488 आनी 41,378 वाचन]], आमी CellSNP आनी Vireo (53) (CelSNP चेर आदारीत म्हणून वापरले कारण GRCh38 कडल्यान दिल्ल्या सामान्य मनशाच्या SNP (VCF) दाताची वळख दितात. डुप्लेक्स म्हणून वळखून घेतिल्लीं पेशी आनी पेशी सोडून जठर आनी अर्बुद नमुन्यांचे (54) ह्या कामाच्या आदाराचेर आमी स्केटर (55) आनी स्क्रॅन (56) बायोकंडक्टर पॅकेजींगांत द्रव्यमान गाळणीचें पावल केल्या उपरांत 697 पेशी मेळ्ळ्यो (अनुक्रमान 2792 आनी 4183 पेशी) विश्लेशणाखातीर आमी अभिव्यक्तीवरवीं क्लस्टर पेशींमेरेनच्या जॅकार्ड अंतराचेर आदारीत आयग्राफाचें (57) लूव्हेन क्लस्टरिंग वापरतात सीडी 8 ए आनी जीझेडएमए हांच्या अभिव्यक्तीवरवीं व्याख्या केल्ली, उण्या रायबोसोमल प्रथिन अभिव्यक्तीचे उपसमूह सोडून आमी इझार आनी हेर (16) हांच्या प्रकाशीत डेटाचो ऍक्सॅस केलो, तातूंत तांचे टी-एसएनई एम्बेडींग सयत, प्रतिकारशक्ती कोशिका निशाण आनी एनएनएमटी अभिव्यक्ती हांचेमदल्या अभिव्यक्ती आडखळाचेर नियंत्रण दवरूं येता.
फिकोल ग्रेडियेंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूजेशन पद्दतीन ल्युकोसाइट वेगळे करपाच्या उत्पादनांतल्यान (STEMCELL Technologies) पीबीएमसी वेगळे केल्ले. सीडी३ मणी (मिल्टेनी) वापरून पीबीएमसींतल्यान सीडी ३ + पेशी वेगळ्यो केल्यो. एमएनएच्या उपस्थितींत वा नासतना सीडी 3+ पेशी प्लेट-बध्द सीडी3 (5μg/ml), विद्राव्य सीडी28 (3μg/ml) आनी आयएल-2 (300 U/ml; प्रोल्युकिन) हांणी सक्रिय केल्लीं. विस्ताराच्या निमाण्या दिसा प्रवाह कोशिकामितीवरवीं जिवीतक्षमताय (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) आनी प्रसार (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) हांचें मुल्यांकन केलें. गोल्गीस्टॉपावांगडा पीएमए (२० एनजी/मिली) आनी आयनोमायसीन (१μg/ml) हांणी पेशींक ४ वरां उत्तेजीत करून प्रभावक कार्याचें मुल्यांकन करप आनी सीडी ८-परसीपी (आरपीए-टी८, बायोलेजेंड), सीडी४-एएफ७०० (आरपीए-टी४) , बायोलेजेंड) आनी टीएनएफα-फ्लुओरेसेन आयसोथियोसायनेट (एफआयटीसी) (एमएबी११, बीडी) हांचेर नियंत्रण दवरप. qPCR आनी ChIP पेशी PMA (20 ng/ml) आनी आयनोमायसीन (1μg/ml) हांणी 4 वरां उत्तेजीत करात. एलिझा सुपरनॅटॅंट पीएमए (२० एनजी/मिली) आनी आयनोमायसीन (१ मायक्रोग्राम/मिली) हांणी ४ वरां उत्तेजन करचेपयलीं आनी उपरांत एकठांय केलें.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) वापरून आरएनए वेगळें करपाक निर्मात्याच्या प्रोटोकॉल प्रमाणें करचें. नमुनो एकजीव करपाखातीर QIAshredder (QIAGEN) वापरात. पूरक डीएनए (cDNA) संश्लेशण करपाखातीर उच्च क्षमताय आशिल्ली आरएनए ते सीडीएनए किट (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) वापरची. जीन अभिव्यक्तीचें प्रमाण (निर्मात्याच्या प्रोटोकॉल प्रमाण) करपाक TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) वापरात: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [ग्लिसरलडीहायड-3-फॉस्फेट ऑफ हायड्रोजन (GAPDH)] आनी Hs01010726_m1 (SLC22A2). नमुने मायक्रोअँप ऑप्टिकल फिल्मा वांगडा मायक्रोअँप फास्ट ऑप्टिकल 96-वेल रिएक्शन प्लेट (अॅप्लायड बायोसिस्टम्स) हातूंत स्टेपवनप्लस रियल-टायम पीसीआर प्रणाली (अॅप्लायड बायोसिस्टम्स) (अॅप्लायड बायोसिस्टम्स)चेर चलयले. खंयचेंय Ct मोल 35 परस चड आसल्यार तें सोदून काडपाच्या थरापरस वयर मानतात आनी तें सोदून काडपाक शकना अशें चिन्न करतात.
आदीं वर्णन केल्ले प्रमाण चिप करप (58). थोडयाच उतरांनी पेशींचेर फॉर्मेलीन (निमाणी सांद्रताय १.४२%) प्रक्रिया करून कोठारांतल्या तापमानांत १० मिनटां उब्यो दवरल्यो. पूरक सुज बफर (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl आनी 0.1% NP-40) बर्फाचेर 10 मिनटां वापरात, उपरांत वर्णन केल्लेप्रमाण प्रतिरक्षी अवक्षेपण बफरांत परतून स्थलांतरीत करात (58). उपरांत नमुन्याक सकयल दिल्ल्या चक्रांनी ध्वनीक्षेपण केलें: १० चक्र (२० १ सेकंद नाडी) आनी ४० सेकंद स्थिर वेळ. चिप ग्रेड इम्युनोग्लोबुलिन जी (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 1μl), हिस्टोन एच3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 3μl), एनएफएटी (इन्व्हिट्रोजन; 3μl) आनी एसपी1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नॉलॉजी; 3μl) प्रतिपिंड नमुन्याचेर रातभर 4°CC शेकचेर उब्यो दवरतात. प्रथिन ए मणी (थर्मो फिशर सायन्टिफिक) नमुन्यावांगडा ४ सॅ.तापमानाचेर हळूच हालोवन १ वरां उब्यो दवरतात, उपरांत डीएनए समृध्द करपाखातीर चेलेक्स मणी (बायो-रॅड) वापरात आनी प्रथिन पचनाखातीर प्रथिनॅज के (थर्मो फिशर) वापरात. पीसीआर पद्दतीन टीएनएफα प्रवर्तक सोदून काडलो: फुडें, जीजीजी टॅट सीसीटी टीजीए टीजीसी टीटीजी टीजीटी; उरफाटें जीटीजी सीसीए एसीए एसीटी जीसीसी टीटीटी एटीए टीजी (२०७-बीपी उत्पादन). इमेज लॅब (बायो-रॅड) कंपनीन प्रतिमा तयार केल्यो आनी इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून प्रमाण थारायल्लें.
कोशिका संवर्धन सुपरनॅटॅंट वयर सांगिल्लेप्रमाण एकठांय केलें. मनशाच्या TNFα एलिझा किट (Invitrogen), मनशाच्या IL-2 ELISA किट (Invitrogen) आनी मनशाच्या IFN-γ ELISA किट (Abcam) ह्या निर्मात्याच्या पद्दतीप्रमाण हें निश्र्चित केलें. निर्मात्याच्या नेमाप्रमाण सुपरनॅटॅंट 1:100 पातळ करून TNFα आनी IL-2 आनी IFN-γ सोदून काडपाखातीर 1:3 पातळ केलें. 450 एनएमचेर शोशणक्षमता मेजपाखातीर EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) वापरात.
फिकोल ग्रेडियेंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूजेशन पद्दतीन ल्युकोसाइट वेगळे करपाच्या उत्पादनांतल्यान (STEMCELL Technologies) पीबीएमसी वेगळे केल्ले. सीडी३ मणी (मिल्टेनी) वापरून पीबीएमसींतल्यान सीडी ३ + पेशी वेगळ्यो केल्यो. एमएनएच्या उपस्थितींत वा नासतना सीडी 3+ पेशी प्लेट-बध्द सीडी3 (5μg/ml), विद्राव्य सीडी28 (3μg/ml) आनी आयएल-2 (300 U/ml; प्रोल्युकिन) हांणी 3 दीस सक्रिय केल्यो. ३ दिसांनी पेशी एकठांय करून ०.९% खारें उदक धुवन गोळी स्नॅप गोठयली. 123count eBeads वापरून फ्लो सायटोमेट्री (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R configuration) पद्दतीन पेशी मेजली.
वयर सांगिल्लेप्रमाण चयापचय पदार्थ काडप. सुकयल्ल्या अर्काची पुनर्रचना ४००० कोशिका समतुल्य/μl ह्या प्रमाणांत केल्ली. रिव्हर्स-फेज क्रोमॅटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) आनी CORTECS T3 स्तंभ (2.1×150 मिमी, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वॉटर्स) हांचेवरवीं नमुन्याचें विश्लेशण करचें. ध्रुवीय द्रव्यमान वर्णपटमापक (6470, Agilent), हातूंत विद्युत् फवारणी आयनीकरण सकारात्मक पद्दतींत काम करता. मोबायल फेज अ हें ०.१% फॉर्मिक आम्ल (H2O मदीं), मोबायल फेज ब हें ९०% एसीटोनायट्रायल, ०.१% फॉर्मिक आम्ल आसता. एलसी ग्रेडियेंट १००% अ खातीर ० ते २ मिनटां, ९९% ब खातीर २ ते ७.१ मिनटां आनी ९९% ब खातीर ७.१ ते ८ मिनटां आसता.उपरांत स्तंभाक मोबायल फेज अ कडेन ०.६ मिलिलीटर/मिनिट प्रवाह दरान ३ मिनटां परतून समतोल करचो. . प्रवाह दर ०.४मिली/मिनिट आसता आनी स्तंभ कोठयेक ५० सॅ. एमएनएचो शुध्द रसायनीक मानक (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) वापरून धारणा वेळ (RT) आनी रुपांतर (RT = 0.882 मिनटां, रुपांतर 1 = 137→94.1, रुपांतर 2 = 137→92 , रुपांतर 3 = 137→78) स्थापन करचो. जेन्ना तिनूय संक्रमण योग्य धारणा वेळार जातात तेन्ना विशिश्टताय सुनिश्चीत करपाखातीर संक्रमण १ हें प्रमाणीकरणाखातीर वापरतात. स्टॉक विरयाच्या (१ मिग्रॅ/मिली) स क्रमीक पातळ करून एमएनए (टोरोंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) चो मानक वक्र तयार करून अनुक्रमान ०.१, १.०, १० आनी १०० एनजी/मिली आनी १.० आनी १० मायक्रोग्रॅम/मिली द्रव अशे मानक मेळयले. सोदून काडपाची मर्यादा १ एनजी/मिली आनी रेखीव प्रतिसाद १० एनजी/मिली ते १०μg/मिली मदीं आसता. दोन मायक्रोलिटर नमुनो आनी मानक हांची दरेक इंजेक्शन एलसी/एमएस विश्लेशणाखातीर वापरतात आनी विश्लेशण मंचाची स्थिरताय सुनिश्चीत करपाखातीर दर आठ इंजेक्शनांनी मिश्र गुणवत्ता नियंत्रण नमुनो चलयतात. सगळ्या एमएनए उपचार केल्ल्या पेशी नमुन्यांचे एमएनए प्रतिसाद परीक्षणाच्या रेखीव आवांठाभितर आशिल्ले. MassHunter परिमाणात्मक विश्लेशण सॉफ्टवेअर (v9.0, Agilent) वापरून डेटा विश्लेशण केलें.
दुसरे पिळगेची αFR-CAR रचना सोंग इ. (५९) हें नांव. थोडयाच उतरांनी ह्या रचनांत फुडले आशय आसतात: सीडी ८ए लीडर क्रम, मनशाच्या αFR-विशिश्ट एकेच साखळीचो चड-उणें कुडको, सीडी ८ए काज आनी पड्ड्याभायर प्रदेश, सीडी २७ कोशिकेभितरलो डोमेन आनी सीडी३झेड कोशिकेभितरलो डोमेन. पुराय सीएआर क्रमांक जेनस्क्रिप्टावरवीं संश्लेशित केलो, आनी उपरांत संप्रेषण कार्यक्षमताय मोलावपाखातीर वापरिल्ल्या जीएफपी अभिव्यक्ती कॅसेटीच्या अपस्ट्रीमांतल्या दुसरे पिळगेच्या लेन्टिव्हायरल अभिव्यक्ती वाहकांत क्लोन केलो.
एचईके२९३टी पेशींचें संक्रमण करून लेन्टीव्हायरस तयार जाता [अमेरिकन टायप कल्चर कलेक्शन (एटीसीसी); दुल्बेकोच्या सुदारीत गरुड माध्यमांत १०% गर्भांतल्या गोवंश रगत (FBS) आनी १% पेनस्ट्रेप आशिल्ल्या, आनी वापरिल्ल्या CAR-GFP vector आनी The packaging plasmids (psPAX2 and pMD2.G, Addgene) हातूंत लिपोफॅक्शन अमायन (Sigma-Aldrich) वापरतात. संक्रमणा उपरांत ४८ आनी ७२ वरां उपरांत व्हायरस आशिल्लें सुपरनॅटॅंट एकठांय करून गाळून अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशनान गाळ केलें. सांद्रीत व्हायरस सुपरनॅटॅंट -८० सॅ.
पीबीएमसी भलायकेन बऱ्या दात्या ल्युकोसायट वेगळे करपाच्या उत्पादनांतल्यान (STEMCELL Technologies) फिकोल ग्रेडियेंट डेन्सिटी सेंट्रीफ्यूजेशन पद्दतीन वेगळे करतात. पीबीएमसींतल्यान सीडी ८+ पेशी वेगळ्यो करपाखातीर पॉझिटिव्ह सिलेक्शन सीडी ८ मायक्रोबीड्स (मिल्टेनी) वापरात. TransAct (Miltenyi) आनी TexMACS माध्यमांत [Miltenyi; ३% उश्णतायेन निश्क्रीय केल्लें मनशाचें रगत, १% पेनस्ट्रेप आनी आयएल-२ (३०० यू/मिली) हांणी पूरक केल्लें]. उत्तेजन दिल्या उपरांत चोवीस वरां उपरांत टी पेशींचें लेन्टीव्हायरस (दर १०६ पेशींक १० μl सांद्रीत व्हायरस सुपरनॅटॅंट) हांणी रुपांतर केलें. सायटेक ऑरोराचेर (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) संप्रेषण केल्या उपरांत 1 ते 3 दिसांनी, उण्यांत उणी 30% संप्रेषण कार्यक्षमताय दाखोवपाखातीर पेशींच्या GFP अभिव्यक्तीचें मुल्यांकन करचें .
CAR-T पेशींची 24 वरां इम्युनोकल्ट (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep हें पूरक) हातूंत फुडल्या परिस्थितींत संवर्धन केलें: उपचार नासतना, 250 μM एडेनोसायन वा 10 mM MNA हांणी उपचार केल्ले. पूर्वप्रक्रिया केल्या उपरांत सीएआर-टी पेशी पीबीएस हांणी धुवन 20,000 एसके-ओव्ही-3 पेशींनी [एटीसीसी; मॅकॉय ५ए माध्यमांत (सिग्मा-आल्ड्रिच) १०% एफबीएस आनी १% पेनस्ट्रेप पुरवण केल्ल्या १० वेळार: १ हें प्रभावक आनी लक्ष्य प्रमाण पूरक केल्ल्या इम्युनोकल्ट माध्यमांत तीन प्रतिकृतींनी प्रवर्धित केलें. डिजिटलिस सॅपोनिन (०.५मिग्रॅ/मिली; सिग्मा-आल्ड्रिच) हांणी लायझ केल्लीं एसके-ओव्ही-३ पेशी आनी एसके-ओव्ही-३ पेशी अनुक्रमान नकारात्मक आनी सकारात्मक नियंत्रण म्हणून वापरलीं. २४ वरां सहसंवर्धन केल्या उपरांत सुपरनॅटॅंट एकठांय करून निर्मात्याच्या सुचोवण्यांप्रमाण (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) लॅक्टेट डिहायड्रोजनेज (LDH) मेजलें. एलडीएच सुपरनॅटॅंट एलडीएच बफरांत १:५० पातळ केलें. मारपाची टक्केवारी सकयल दिल्ल्या सूत्राचो उपेग करून मेजली: मारपाची टक्केवारी = दुरुस्तीची टक्केवारी / चडांत चड मारपाचो दर x 100%, जंय दुरुस्तीची टक्केवारी = फकत सह-संस्कृती-टी पेशी, आनी चडांत चड मारपाचो दर = सकारात्मक नियंत्रण-नकारात्मक नियंत्रण.
मजकूरांत वा साहित्यांत आनी पद्दतींत वर्णीत केल्ल्या प्रमाण, सांख्यिकी विश्लेशणा खातीर GraphPad Prism 8, Microsoft Excel वा R v3.6.0 वापरात. एकाच दुयेंती कडल्यान जायते नमुने एकठांय केल्यार (देखीक जठर आनी अर्बुद), आमी जोडीदार टी चांचणी वापरतात वा योग्य ते प्रमाण रेखीव वा सामान्यीकृत मॉडेलांत यादीक परिणाम म्हणून दुयेंतीचो आस्पाव करतात. चयापचयशास्त्र विश्लेशणाखातीर म्हत्वाची चांचणी तीन प्रतिकृतींनी करतात.
ह्या लेखा खातीर पूरक साहित्या खातीर, उपकार करून पळयात http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
हो क्रिएटिव्ह कॉमन्स एट्रिब्यूशन-बिगर वेपारी परवान्याच्या नेमा खाला वितरीत केल्लो मुक्त प्रवेश लेख आसा, जो खंयच्याय माध्यमांत वापर, वितरण आनी पुनरुत्पादन करपाक परवानगी दिता, जो मेरेन निमाणो वापर वेवसायीक फायद्या खातीर ना आनी मूळ काम बरोबर आसा असो आदार आसा. संदर्भ.
टिप: आमी तुमकां फकत तुमचो ईमेल पत्तो दिवपाक सांगतात, जाका लागून तुमी पानाचेर शिफारस करतात त्या मनशाक तुमकां ईमेल पळोवंक जाय आनी तो स्पॅम न्हय हें कळटलें. आमी खंयचेच ईमेल पत्ते कॅप्चर करचे नात.
तुमी भेटीदार आसात काय ना हाची चांचणी करपाक आनी आपोआप स्पॅम सादर करपाक आडावपाक हो प्रस्न वापरतात.
मारिसा के.किलगॉर (मारिसा के जी.जोन्स), फिनेस टी.हॅमिल्टन (फिनेस टी.
एमएनए टी पेशींची रोगप्रतिकार शक्त दमन करपाक योगदान दिता आनी मनशाच्या कॅन्सराचेर उपचार करपाखातीर संभाव्य प्रतिकारशक्ती उपचाराचें लक्ष्य दाखयता.
मारिसा के.किलगॉर (मारिसा के जी.जोन्स), फिनेस टी.हॅमिल्टन (फिनेस टी.
एमएनए टी पेशींची रोगप्रतिकार शक्त दमन करपाक योगदान दिता आनी मनशाच्या कॅन्सराचेर उपचार करपाखातीर संभाव्य प्रतिकारशक्ती उपचाराचें लक्ष्य दाखयता.
©2021 अमेरिकन असोसिएशन फॉर द अॅडव्हान्समेंट ऑफ सायन्स. सगळे हक्क राखीव आसात. एएएएस हिनारी, अगोरा, ओआरे, कोरस, क्लॉकएसएस, क्रॉसरेफ आनी काउंटर हांचो भागीदार आसा. सायन्सएडव्हान्सेस आयएसएन 2375-2548.